研究課題
細胞分裂を制御する分子メカニズムは非常に複雑であるが厳密である。本研究では植物細胞の染色体分離制御に着目し、チェックポイントタンパク質に対するSUMO翻訳後修飾の関わりを解明し、詳細な分子機構を明らかとすることを目的に研究を行った。本研究でチェックポイントタンパク質の一つとして着目したシロイヌナズナのオーロラキナーゼにはこれまで突然変異体の報告がされていない。そのため、artificial microRNAによるノックダウン系統を作製しており、複数の系統で生長の遅延と形態異常が観察されていた。本年度は確立されたノックダウン系統を用いて、DNA damage agentに対する感受性の検定を行った。DSBを誘起するZeocin、DNAの架橋を引き起こすCisplatinを用いた試験を行い、いずれのDNA障害に対しても、野生型植物体より低濃度の処理条件において矮化することを確認した。さらに、機能的なゲノム配列を用いて作成したGFP融合タンパク質発現コンストラクトによる形質転換体を確立し、観察を行った。定常状態において、両タンパク質のGFPシグナルは染色体上のセントロメア近辺と推定される個所で観察され、野生型の配列のものとSUMO-null型配列のものとで有意な変化は観察できなかった。また、本年度、当研究室においてCRISPR/Cas9システムによるジーンターゲッティングの動作を確認することができたため、本研究にもこれを適用し、ノックアウト株の作出を試みている。これまでに報告されている変異体コレクション中にはAUR3遺伝子を破壊するような形となるものは発見されていない。これまでに人工的にデザインしたsgRNA配列を作製し、Cas9配列と共にシロイヌナズナ野生株に形質転換し、T1植物体を作製している。
2: おおむね順調に進展している
当初計画とほぼ相違ないペースで相補実験が進んでいる。artificial microRNAによるノックダウン系統の作製と確立、相補コンストラクトによる機能検証を終了し、機能的なゲノム配列を確定させている。また、この配列を用いてGFP融合タンパク質発現コンストラクトを作製し、その観察も行っている。さらに、いくつかのDNA損傷試験を行い、その作用を確認することができている。一方で、新たにゲノム編集による機能欠失変異体の作出に取り組み、既にその元となる形質転換体を取得している。この系統を利用して機能欠失変異体を作製し、その表現型を観察することで、さらに議論を深めることができると考えている。また、本年度には葉肉細胞のプロトプラストを用いた免疫沈降実験手法の条件検討を終えており、今後も当初計画通りにデータを取得できるものと考えている。
本年度成果の研究成果より、研究対象としたチェックポイントタンパク質の機能的なゲノム配列を用いたGFP融合コンストラクトの作製とその局在観察にはSUMO化の有無による影響は無いか、大きくないことが推定された。そのため、今後は相互作用タンパク質との関係性やSUMO-null型変異体の表現型観察に軸足を置き、研究を推進する計画である。また、本年度新たに取り組んだ、CRISPR/Cas9システムによる機能欠失変異体の作製に注力する計画である。これまで検証してきたノックダウン系統の知見を土台として表現型の観察を行うことで、当初計画よりも知見を深めることができると考えている。これまでにsgRNA及びCas9を導入した形質転換体の作製は終えており、次年度にはT2世代およびT3世代を用いたスクリーニングを行うことで、変異体を取得することができると考えている。顕微鏡観察手法や生化学実験・培養細胞を用いた実験手法など、現時点で順調に進んでいるものであっても今後何らかのアクシデントが生じた場合の対応策として共同研究者・研究協力者と適宜協議・議論を行い進めていきたいと考えている。
本年度はおおむね順調に研究を進めることができたと考えている。一方、次年度にはプラスチック消耗品や分子生物学実験キットなどの計画上の消耗品の購入に加え、実験をサポートする技術補佐員の雇用を計画している。これは、本年度になって新たに取り組んだゲノム編集による変異体作成のため、多くの植物体の維持・管理を行う必要が生じたためである。機能欠失型変異体を作製し表現型を検証することで、当初計画よりも大きな成果をあげることができるものと考えている。
実験機器や試薬・消耗品など本研究専用に使用することで研究の推進が図れるものに関しては、随時購入する。特に本年度作出したゲノム編集による機能欠失型変異体作出のため、形質転換植物体の育成のため技術補佐員を雇用する予定である。その他、試薬・プラスチック消耗品および植物育成用土を購入する。当初計画よりも多くの植物体を用いることにより研究成果の増大をはかっており、その実現のため物品費及び謝金に供する計画である。
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