| 研究課題/領域番号 |
25440147
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| 研究機関 | 独立行政法人日本原子力研究開発機構 |
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研究代表者 |
坂本 綾子 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 原子力科学研究部門 量子ビーム応用研究センター, 研究主幹 (00354960)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 損傷乗り越え複製 / 環境応答 / ゲノム安定性 / 相同組換え / 熱ショック蛋白質 |
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| 研究実績の概要 |
損傷乗り越え複製は、DNA修復機構によって除去しきれなかったDNA損傷をバイパス複製することにより、DNA複製が停止するのを回避する機構の一つである。本研究では、損傷乗り越え型ポリメラーゼとDNA複製装置、熱ショック蛋白質(HSP)、相同組換え関連因子等との相互作用を生化学的・分子遺伝学的手法で解析することにより、高等植物がゲノムの安定性を脅かす様々なDNA損傷ストレスに対してどのように対処しているかを明らかにすることを目的としている。
H26年度は、前年度に確立した相同組換え検出系統を利用し、植物ゲノムの安定性維持において損傷乗り越え型ポリメラーゼや熱ショック蛋白質が果たす役割を解析した。また、PCNA-ユビキチン融合蛋白質導入植物を利用し、DNA複製因子の修飾が植物のDNA損傷応答において果たす役割を検証した。
1) 相同組換えマーカーを導入した植物をHSP阻害剤の存在下で育成し組換え頻度を解析した結果、HSPの阻害によりDNA相同組換えの頻度が上昇することを明らかにした。さらに、組換えマーカーを導入した損傷乗り越え型ポリメラーゼ欠損株にHSP阻害剤を添加すると、ポリメラーゼ欠損の効果とHSP阻害剤の効果が相加的に効くことを見出した。
2) PCNA-ユビキチン融合蛋白質を導入した植物を選抜し、試験系統を確立した。この遺伝子導入植物からFLAGタグを利用してPCNAを回収し、ユビキチン化の検出を試みた。
3) 損傷乗り越え型ポリメラーゼの欠損系統mmc41系統に突然変異検出マーカーを導入し、試験系統を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
損傷乗り越え型ポリメラーゼの欠損系統を用いた解析、及びHSP90阻害剤効果の検証については予定通り達成出来た。また、PCNA-ユビキチン融合蛋白質を導入した植物を選抜し、試験系統を確立した。しかし、所属機関の建物工事により実験に必要な植物を育成するスペースを確保出来ず、HSP90ノックダウン系統を用いた解析は十分に行うことが出来なかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
H27年度は、前年度までに作製した試験系統に対して様々なDNA損傷刺激を加え、DNA損傷刺激の種類やポリメラーゼの有無によって突然変異頻度や相同組換え頻度に違いがあるかどうかを解析する。また、HSP90と損傷乗り越え型ポリメラーゼとの関係性を解析する。得られた結果を総合的に分析することにより、植物のゲノム安定生維持がどのように制御されているかを明らかにする。これとともにPCNA導入植物からPCNAを精製する際に共沈して来る蛋白質を探索することで、DNA複製装置と相互作用する新規蛋白質を探索する。
1) 野生型および損傷乗り越え型ポリメラーゼ欠損株、HSP90ノックダウン株に対して、紫外線、放射線、酸化ストレス、熱ショックなどのDNA損傷刺激を与え、突然変異や相同組換えの頻度に差異が見られるかどうかを解析する。
2) PCNA導入植物からFLAGタグを用いてPCNAを精製し、抗体を用いてユビキチン化を解析する。また、PCNA導入植物に対して様々なDNA損傷刺激を与えた際に、ユビキチン化の状況に変化が見られるかどうかを解析する。
3) 紫外線、放射線、酸化ストレス、熱ショックなどを与えた植物からpull-down assay等の方法でDNA複製装置複合体を抽出し、DNAに損傷を受けた際にDNA複製装置と相互作用する蛋白質を探索する。候補となるスポットが得られたらpeptide fingerprint (PMF) 等によって分析し、同定を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
所属機関の建物工事により植物を育成するスペースを十分に確保出来ず、やむなく実験規模を大幅に縮小して解析を行ったため、植物育成用資材や解析試薬の購入費が減少した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
H27年度は新たな植物育成温室が完成し、実験スペースも十分に確保されると予想されるため、実験規模を拡大してデータ収集を行う予定である。このため、実験の補助を行うテクニカルパートタイマーを雇用するほか、必要な実験試薬や植物育成資材を購入する予定である。
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