| 研究課題/領域番号 |
25440150
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
西野 敦雄 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (50343116)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 神経筋結合 / 運動制御 / アセチルコリン受容体 / グリシン受容体 |
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| 研究概要 |
尾索動物ホヤの幼生は、脊椎動物とボディプランを共有したオタマジャクシ形態を示し、海洋中を自由に泳ぐ。しかしホヤ幼生は、ギャップ結合で電気的に連結された片側わずか約20個（左右で計約40個）の筋肉細胞を備えるのみである。申請者は近年、このホヤ幼生の少数の筋細胞群が、「可変的な強度をもって前後に伝播する屈曲波を生み出す仕組み」を研究している。本研究の目的は、この幼生の筋肉帯において、アセチルコリンによって担われる興奮性のシグナルばかりでなく、グリシンによって担われる抑制性のシグナルを受容することが、筋肉帯が「可変的な強度をもって前後に伝播する屈曲波を生み出す」上で本質的であることを確証することである。本研究によって、長くアセチルコリンによる単一支配が信じられてきた脊索動物の神経―筋システムが新たに捉えなおされるための重大な契機を与えられると期待される。
本年度は、これまで解析を行ってきたカタユウレイボヤに加えて、新たにゲノムの解読がなされたマボヤについて、アセチルコリン受容体（nAChR）とグリシン受容体（GlyR）のクローニングを行った。マボヤのほうがカタユウレイボヤより胚がかなり大きく、また発生の進行もゆっくりであるため、本研究で計画している、割球を同定した上で割球ごとに配列特異的発現阻害剤の注入を行う実験が相当に容易にできるようになると考えた。その結果、カタユウレイボヤで筋肉に発現していたnAChRとGlyRの全てのサブユニットについてのクローニングと、全長配列の決定が終了した。今後は、マボヤについて、カタユウレイボヤ同様に幼生の筋肉において、nAChRとともにGlyRの発現が観察されるかを検証し、さらにこれらをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させることによって、アセチルコリンとグリシンに対する反応性を示すかを電気生理学的に確証していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度はこれまで研究材料としてきたカタユウレイボヤに加えて、マボヤを研究材料にするために、新たにマボヤから本研究の目的の達成に必要なcDNAのクローニングを行った。このことは一見遠回りに思われるが、最終的には研究目的の達成に対してより早くアプローチできると期待して判断した。そのために、当初計画からはやや遅れているものの、最終的には科学的には確実性の高いデータが得られ良好な結論が導けると考えている。研究材料としてのマボヤはカタユウレイボヤに比べ、卵殻が付いたままの胚の特定の割球に対して操作を加えることについては圧倒的なアドバンテージを保持している。それに対してカタユウレイボヤのほうがマボヤより世代時間がかなり短いために、遺伝学的な手法を用いる意味ではマボヤよりカタユウレイボヤのほうが優れている。これら二つの材料を同時に使用できる体制を研究室に確立しておくことによって、目的に応じてこれら二つの研究材料を使い分け、仮説の適切な検証を適切な材料において進めていくことができる。
また本年度は研究代表者が現所属において、実質的に研究室の立ち上げを行った年であり、研究室の研究環境の整備や学生の指導に多大な時間を使った。本年度においてカタユウレイボヤとともにマボヤの飼育維持・分子生物学・電気生理学が可能な実験室の環境は整い、またそれによって遺伝子クローニングと生理実験が可能になった。その意味では進行は順調であるが、当初の計画で期待される結果がカタユウレイボヤにおいて得られたかといえば未だ不十分であることは否めず、現状を「やや遅れている」状態とした。しかし、研究期間全体を通した進み行きとしては、目的の達成に対しよい方向に進んでいるということができる。
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| 今後の研究の推進方策 |
我々は今後、まずクローニングしたマボヤのnAChR幼生が筋肉で、GlyRが筋肉と運動ニューロンで発現していることを確かめ、さらにそれぞれをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させて、各々のリガンドに対する電気的な応答を調べる。GlyRについてはイオン選択性フィルターに対応する部位に人工的な変異を導入し、本来のCl-透過性から陽イオン透過性を持つものに改変をほどこす。
これらの準備段階を経て、マボヤにおいてGlyRに対する配列特異的発現阻害剤であるモルフォリノオリゴ（MO）（既に準備済み）を、筋肉を生じる割球（B4.1）対にあるいは運動ニューロンを生じる割球（A4.1）対に注入する実験を行う。これにより運動ニューロンにおけるGlyRの発現抑制が遊泳運動に及ぼす効果と、筋肉におけるGlyRの発現抑制が遊泳運動に及ぼす効果を比較し、各部位での機能の違いを明らかにすることで仮説の検証を行う。このとき、MOによる抑制をした上で正常なGlyRで機能をレスキューできるか、あるいは陽イオン透過型に人工改変したクローンでレスキューするとどのような運動パターンが引き起こされるのかについても検証する。
カタユウレイボヤとマボヤの筋肉帯に対して微小電極による細胞内電位の計測を行い、抑制性の電位変化（過分極応答）が確認できるか調べる。必要に応じて、GlyR阻害剤や筋肉へのMO注入を行った幼生を用いることで、過分極応答がGlyR依存的であるかを検証する。
既に用意したカタユウレイボヤGlyRに対する抗体を用い、また、これも既に用意したGFPのタグをつけたGlyRを筋肉細胞に発現させる実験によって、その筋肉における局在パターンを調べる実験も行う予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
実支出額が当初所要額に近づいたため、すぐに必要なもの以外の支払いを単純に行わなかったためである。物品の購入、旅費、謝金の支出は計画的に行い、本年度必要なものは入手することができた。いくつかの物品については購入時に割引などがあり、当初計画よりわずかだが安価に入手できたものもある。
当初計画に加えて、実験補助者に対する謝金の支払いを計画している。そのかわり、当初購入を予定していたPCの購入が、別途入手できたために不要になったので、その資金を充当する計画である。その他については次年度の研究計画に則って、必要な物品の購入、旅費への支出に使用する。研究目的の達成に全力を尽くす。
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