研究課題
本研究は遺伝子変異メダカを用いて新規ステロイド膜受容体（mPR）を介したシグナル伝達の生理機能についての確証を得ること、さらにその反応が出発点となる排卵誘導に関わる遺伝子群を明らかにすることを目的とする。メダカゲノムにはmPRの4種類の遺伝子が存在するが、昨年度までに4種類の遺伝子α,β,α-2,γの変異系統を得た。26年度はこれら4系統のゲノムクリーニング（目的変異以外の変異を野生型との交配により除く）を進めるとともに、mPRγ系統についてはホモ型を作出し、予備的な表現型解析を行った。他系統と同様、特に異常は見られずmPR遺伝子間には冗長性が見られることが確認できた。そこで様々な組み合わせの2重、3重変異体についても交配を進めた。mPRの機能解明についてはmPR安定発現培養細胞株にさらに改変ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞株を樹立し、ステロイドホルモン作用による細胞内cAMP濃度低下をリアルタイムに検出できる系を確立した。この成果は論文として投稿し、掲載が受理された。排卵誘導遺伝子群の解明については、文部科学省科学研究費、新学術領域研究「ゲノム支援」に採択され、これまで行ったマイクロアレイ解析に加え、より精度の高いと考えられるRNA-seqによる解析が可能となった。そこでゼブラフィシュ新規排卵誘導法により調製した４種類の試料（未処理、卵成熟誘導２種、排卵誘導）さらに自然条件下での卵成熟誘導群、排卵誘導群からの試料調製も行い、RNAseqにより遺伝子発現解析を行った。その結果、マイクロアレイ解析とRNA-seqのデータの間には大きな相違がみられることが明らかとなった。今後、その原因を精査するとともに個々の候補遺伝子について定量PCRにより発現解析結果の検証を行い真の排卵誘導遺伝子を選択する。
1: 当初の計画以上に進展している
mPR遺伝子変異メダカ系統の樹立については掛け合わせ、ジェノタイピングによる遺伝子変異の確認と順調に進み、表現型解析に用いることができるF6世代以上までの継代は完了に近づいている。表現型が期待できる多重変異体の作出も開始し、計画通りにメンデルの遺伝法則に従い変異系統が得られている。細胞内cAMP濃度低下をリアルタイムに検出できるセルーベースアッセイ法については論文発表することができた。この培養細胞株を使ったアッセイ法が確立できたことによりmPRが予想通り抑制性Gタンパク質と共役していることが実証されたと言える。最終的にはノックアウトメダカによる表現型解析による証明が必要であるがmPRの機能についての否定的な見解を正す上で大きな意味のある結果であった。一方、「ゲノム支援」事業に採択され、排卵誘導遺伝子を解明するためにRNA-seq解析を実施できた。データの解析は今後の課題であるが重要なデータが得られた。
脊椎動物間で保存されているmPRの3種類のサブタイプの内、mPRαとmPRβは比較的相同性が高く、これらには冗長性があると判断され、変異体の表現型を観察するためには多重変異体を作出する必要があると考えられる。実際にこれらを掛け合わせ、2重変異体を作出したが、表現型は見られなかった。メダカにおいてはさらにα遺伝子の重複遺伝子と考えられるmPRα-2遺伝子が存在するため、これらの3重変異体の作出が必要であると考えられる。mPRγについても変異系統を得たので、3重変異体にも変異が見られない場合は最終的に4重変異体の作出も試みる予定である。今後、何らかの変異形質が見られることを期待する。RNA-seqによる遺伝子発現解析の結果、マイクロアレイ解析とRNA-seqのデータの間には大きな相違がみられることが明らかとなった。今後、その原因を精査するとともに個々の候補遺伝子について定量PCRにより発現解析結果の検証を行い真の排卵誘導遺伝子を選択する。RNA-seqのデータについては試料間での誤差があまりみられず、極めて安定性の高いデータである。したがって、データの相違はマイクロアレイ解析における偽陽性が原因であると考えられるが、慎重に検討したい。排卵誘導遺伝子候補についてはマイクロアレイ解析とRNA-seqのデータを比較し、転写因子群に候補を絞り、発現変動解析を実施する。変動が確認されれば鍵遺伝子を予測し、遺伝子変異魚の作出を開始する。新たな遺伝子変異個体の作出法であるCRISPR/Cas9法について導入準備を進めているところである。
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Steroids
巻: 100 ページ: 21-26
Chemosphere
巻: 109 ページ: 128-133
10.1016/j.chemosphere.2014.01.029
https://www.youtube.com/watch?v=9Bf6a7fO1qA
