| 研究課題/領域番号 |
25440156
|
|---|
| 研究機関 | 広島大学 |
|---|
研究代表者 |
中坪 敬子(光永敬子) 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (40192760)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | アリールスルファターゼ / 細胞外基質 / 分子環境構築 / 形態形成 |
|---|
| 研究実績の概要 |
細胞外基質アリールスルファターゼ（ArsB）による形態形成制御機構を解明するために、メダカを用いて、以下の研究を実施した。
１. ArsBの分子環境の解明……ArsBを核とした細胞外基質の分子環境を明らかにするために、細胞外分泌型ArsBを主に発現しているメダカ脳を用いて、第三脳室脈絡叢、菱脳室の構造に注目し、ArsBの局在を細胞外基質を保持した条件下の免疫電顕により精査した。第三脳室脈絡叢のArsB の反応は、髄膜由来の発達した間質細胞の細胞質内顆粒状構造と細胞膜、上皮細胞のライソゾーム、小胞体、細胞膜、糖衣で認められた。間質細胞と上皮細胞で合成されたArsBの脳室内への分泌の可能性を検討している。菱脳室は、脈絡叢の発達は悪いが、菱脳室底に上衣細胞が特殊化した分泌細胞が占める領域があり、ArsBの発現と分泌細胞との対応を調べている。
２. ArsBの分子環境構築機構の解明……ArsBの分子環境を形成するArsBの輸送経路を調べる目的で、固定した脳を樹脂包埋し、ArsB の局在を確認した領域の純形態微細構造を電顕により観察した。第三脳室脈絡叢でArsBの顕著な発現を認めた密集した間質細胞の内部には、繊維状の構造物を含む多数の顆粒状の構造体があり、これらには、小胞体、細胞膜と繋がっているものがあった。上皮細胞には、発達した微絨毛と密着結合が認められ、電子密度が高い暗調細胞も含まれていた。菱脳室底に関しては、分泌細胞の形態をより保持した電顕の条件検討を行っている。これらの構造は、ArsBが脈絡叢から脳室内に分泌されて機能している可能性を支持する。
３. ArsB発現異常の影響解析……TALENにより、ArsBのスルファターゼドメインからC末側を破壊したメダカを作成した。初期発生には、顕著な影響が認められなかったことから、後期発生の形態形成における機能を解析している。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究は、細胞外基質ArsBの組織特異的な分子環境とその構築機構及びArsBの変異が形態形成に及ぼす影響を解析することにより、ArsBによる形態形成制御モデルの構築を目指している。メダカ脳を用いた解析では、昨年度までに、細胞外基質を固定した条件下での免疫染色によりArsBの局在解析を可能にした。第三脳室では発達した脈絡叢を、菱脳室底では、上衣細胞が特殊化した分泌細胞を検出し、脳脊髄液循環を介したArsB細胞外基質環境の形成機構が示唆されていた。本年度は、第三脳室に関しては、免疫電顕と電顕による脳純形態の微細構造解析により、ArsBの間質細胞の顆粒状構造体から細胞外へ、上皮細胞の頂端側から脳室内への分泌を示唆する結果が得られた。菱脳室に関しては、ArsB の発現と分泌細胞との対応をより精度の高い方法で検討する段階になっている。分子環境の構築機構に関しては、ArsBの顕著な局在を認めた間質細胞の顆粒状構造とその内部の繊維状構造の特定、ArsB の局在を確認した構造の相互関係、ArsBの発現の発生過程における変化等を調べることにより、ArsB供給経路を、より明確にすることが可能になってきた。メダカとの比較対象であるラットの脳におけるArsB の局在解析も平行している。ArsB発現異常メダカについては、スルファターゼドメインのアミノ酸変異体に加えて、スルファターゼドメインからC 末側を欠失させた個体を作製したが、飼育設備の工事により、成長が遅れた。ArsB変異メダカを安定して維持できるようになったので、ArsBの欠失が後期発生に及ぼす影響を解析している。これらの課題を解決して、結果を結びつけることで、研究目的の達成に務めたいと考える。
|
| 今後の研究の推進方策 |
１. 細胞外基質ArsBによる形態形成制御モデルの構築……メダカArsBの分子環境、分子環境構築機構、ArsB発現異常の影響解析を継続して行う。ArsBの分子環境の解析では、脳の形態をより保持した条件下での免疫電顕、ArsB と細胞外基質との局在比較を行う。分子環境構築機構に関しては、ArsBの発現を認める細胞内構造の精査、発生過程におけるArsBの発現領域の変化の解析、ArsBと脈絡叢分化マーカーとの多重染色等を行うことにより、ArsBの輸送経路を明らかにする。ArsB 発現異常メダカの解析では、トランスジェニック個体と交配することにより、形態形成に及ぼす影響を詳細に調べる。以上の結果を統合して、ArsBを含む細胞外基質環境の特徴とその構築経路、その結果がメダカの形態形成にどのように関与するのかを示す暫定モデルを構築する。
２. 細胞外基質ArsBによる形態形成制御モデルの検証……ArsB変異メダカにおける細胞外基質環境への影響、脳脊髄液の輸送経路の抑制がArsBの分泌、局在に及ぼす影響等を解析することにより、暫定モデルを検証し、精度の向上を目指す。
|
