| 研究課題/領域番号 |
25440160
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
長谷部 孝 日本医科大学, 医学部, 准教授 (70329027)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 消化管 / 幹細胞 / 甲状腺ホルモン / Notch / Cre-Loxシステム |
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| 研究概要 |
アフリカツメガエル幼生の消化管を構成する上皮細胞は、甲状腺ホルモンが高まる変態期にそのほとんどが除去されるが、一部が脱分化して成体型上皮幹細胞となる。本研究では、この消化管再構築に関して、(A) 成体型上皮幹細胞の起源、(B) 幹細胞制御におけるNotchシグナル経路の役割を明らかにすることを目的としている。
A. 幹細胞を標識するために、(i) Creドライバー、(ii) CreレスポンダーのTgラインの確立を目指している。(i) では、成体型幹細胞特異的に発現する遺伝子のゲノム上流の単離を行った。これまでにROR2のゲノム上流約3Kbを単離し、Tg用のDNAコンストラクトを作製した。Hairy1のゲノム上流の単離も進行中である。(ii) では、Creの作用によりRFPを発現するTgラインの確立を目指して、CAGプロモーターおよびEF1aプロモーターを用いたコンストラクトを作製した。
B. Aの原理を応用し、Notch経路に関与する遺伝子の過剰発現系を構築中である。転写因子Su(H)の変異体（機能阻害）、Notch-ICD（機能亢進）の遺伝子をそれぞ製し、Creレスポンダーとしてそれぞれコンストラクトを作製した。Creドライバーとしては、Dox誘導によりユビキタスにCreを発現するコンストラクトを作製した。
その他、変態期の小腸を用いてHairy1とHairy2bの発現解析を行ったところ、Hairy1は成体型上皮幹細胞特異的に、Hairy2bは結合組織特異的に発現が高まること、Notch阻害剤の投与によりこれらの発現上昇が抑えられることがわかった。
本研究により幹細胞の起源と幹細胞制御におけるNotchシグナルの新たな役割を解明することができれば、幹細胞研究の分野でたいへん意義深いものとなる。また、両生類研究において新たな技術を提供することができる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
目的には、(A) ではCreレスポンダーTgラインの確立、Creドライバーのプロモーター特異性の確認、(B) ではCreドライバーのTgラインの確立をそれぞれ含めていたが、達成できていない。
理由としては、主として以下のことが挙げられる。
(1) プロモーターの単離が困難である。Genomeを鋳型にgenome walking法で単離を試みたが、目的のDNAが増幅されるまでに、条件検討等に多くの試行錯誤を要する。
(2) Tg用のDNAコンストラクトのクローニングが困難である。インシュレーターやリコンビナーゼ認識配列など、クローニングの妨げとなる繰り返し配列を多く含むため、目的のコンストラクトの作製に手間取る。
(3) Tg作製効率が低い。Tol2リコンビナーゼを用いてTg作製を行うが、文献に従った実験方法では高効率のTg作製が行えず、条件検討等に多くの試行錯誤を要する。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの遅れを取り戻すため、今後はTg作製に注力し、早期のライン化を目指す。
平成26年度は、引き続きTg作製を行う。Tgラインを確立した場合は、ダブルTgの作製を行い、得られたTgでの目的遺伝子の発現解析を行う。組織特異的なプロモーターが単離できなかった場合は、引き続きゲノムからのクローニングを行う。
平成27年度は、Cre-Loxシステムを利用した (A) 細胞系譜の追跡による幹細胞の同定、(B) Notchシグナルの活性化/阻害が消化管再構築に及ぼす影響の解析を行う。
平成28年度は、平成27年度までに得られた知見を基に、再実験や追加実験を行う。さらに、必要であればConditional Knock-DownもしくはConditional Knock-Outの系の確立を目指す。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成25年度に前倒し請求をしたが、10万円単位での請求しか可能でなかったため、次年度使用額が生じた。
物品費（主として消耗品費）として使用する予定である。
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