| 研究課題/領域番号 |
25440210
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| 研究機関 | 奈良女子大学 |
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研究代表者 |
春本 晃江 奈良女子大学, 自然科学系, 教授 (80198936)
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| 研究分担者 |
洲崎 敏伸 神戸大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (00187692)
飯尾 英夫 大阪市立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (80145771) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 交配フェロモン / 接合 / 交配型 / 種分化 |
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| 研究実績の概要 |
繊毛虫ブレファリズマ（Blepharisma）には相補的な接合型Ⅰ型とⅡ型があり、それぞれの接合型が出す交配フェロモン（ガモン１とガモン２）がお互いを誘引し、接合対形成へと導く。ガモン１は糖タンパク質で、異種間では基本的にガモン１は作用しないと考えられている。一方、ガモン２はアミノ酸誘導体であり、種を越えて作用すると考えられている。平成27年度には、①他種のブレファリズマからガモン2を単離し、それらがB. japonicumのガモン２と同じ物質であることを確認した。ガモン２の生合成経路を解明するために、IDO（Indoleamine 2,3-dioxygenase）遺伝子の相同遺伝子を単離することを試みた。また、②ブレファリズマの種が分化してきた道筋を探るために、ブレファリズマの株の採集と培養および種の同定を行い、18SrRNA遺伝子やヒストン遺伝子等の塩基配列を調べ、系統樹を作製した。また、Megakaryotype IIとIVの間では接合対形成がほとんど起こらないが、Megakaryotype ⅢとIVの間では比較的効率に接合対が形成されることを明らかにし、その際の核変化が正常に行われているかを調べた。③ガモン1については、その発現が細胞の飢餓状態と関連していることから、強制飢餓にした場合にどの位の時間でガモン1の転写・翻訳が行われるかどうか、またガモン1の発現は細胞周期と関連性があるかについて論文をまとめ、J. J. Protozoologyに受理された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①繊毛虫ブレファリズマにおける性フェロモンの機能と作用機構を明らかにするために、数種のブレファリズマからガモン１遺伝子を単離し、塩基配列を比較したところ、種を境に変異が生じている部位が２箇所あることを見つけた。この２箇所がガモン１の種特異性を決めていると考えられ、受容体への結合部位に関係する可能性が示唆された。また、質量分析により、4箇所の糖鎖結合部位のいずれにも糖鎖が結合していることと、6種類の糖鎖構造が存在することがわかった。また、ガモン1のN末端はグルタミンで、プログルタミンの修飾を受けており、ガモン1は278アミノ酸残基から成ることが明らかになった。②ガモン1の発現は、対数増殖期の細胞を強制飢餓においても開始されること、約1.5時間で転写が開始され、3時間程度で細胞外に放出されることがわかった。③B. americanum とB. undulansのガモン2を単離精製し、カラムクロマトグラフィーと質量分析によりB. japonicumのガモン2と同じ物質（3-(2 -formylamino-5 -hydroxy- benzoyl) lactate）であることを確認した。④さまざまな株を用いて18SrRNA遺伝子、ヒストンH4遺伝子、COI遺伝子を単離し塩基配列を調べて系統樹を作製した。また、異なるMegakaryotypeに属する株を、それぞれ特異的なガモンで処理して活性化した細胞を混合し、接合対ができるかを調べたところ、Megakaryotype II とIII 、IIとIV間では、接合対はほとんど形成されなかったことから、種間の接合をブロックする機構が接合過程に少なくとも2箇所存在することを明らかにした。しかしIIIとIVの間では接合対は比較的高率に形成されたことから、Megakaryotypeにより接合対形成の起こりやすさには差があると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
繊毛虫ブレファリズマにおける性フェロモンの機能と作用機構を明らかにする課題：Blepharisma japonicumではない他の種や他の株のガモン1でも同様に糖鎖の不均一性が見られるのか、また、今回わかったN末端までを含む組換えガモン1の活性を調べること、また酵母や他の発現系を用いてランダムに結合させた糖鎖で接合活性が見られるのかについて検討することなどが今後の課題である。また、5-OH-L-tryptophan（5-HTP)と抗5-HTP抗体を用いたⅠ型細胞におけるガモン2受容体の検出をさらに進め、 5-HTP がガモン2受容体に結合しているかどうかを検証する。ガモン１抗体を用いて、同様にⅡ型細胞におけるガモン１受容体の局在を検証する。さらにガモン1およびガモン2受容体を単離する試みも行う。ガモン2の生合成経路の解明に向けて、IDO遺伝子等の単離を進める。また、相手の型のガモンによって活性化された細胞では、どのような形態変化が見られるかを、更に詳しい電子顕微鏡的観察を行って明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究はほぼ順調に進んでいるが、目的をより精緻に達成するための実験を遂行したいことと、これまでの成果を数編の論文として準備中であり、これらに研究費を使用したいため、補助事業期間を延長することとなった。加えて、平成27年度より代表者が大学の教育研究評議員となり、多くの業務にかかわらざるを得なくなり非常に多忙となった。また、身内（夫）が要介護3となったが、他に介護者がおらず代表者が介護を担っており多忙であるため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
ガモン2の生合成経路の解明に向けて、IDO遺伝子等の単離を進める。異種間の接合により核変化は正常に行われるのか、子孫は得られるのかを調べる。また、これまでに得られた結果を学会で発表すると共に、論文にして査読付き学術雑誌に発表する。
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