2013 年度実施状況報告書

人工制限酵素を用いた高効率イネ葉緑体ゲノム編集の確立

研究課題

研究課題/領域番号	25450002
研究種目	基盤研究(C)
研究機関	徳島大学
研究代表者	刑部敬史徳島大学, 農工商連携センター, 教授 (70450335)
研究期間 (年度)	2013-04-01 – 2016-03-31
キーワード	葉緑体 / ゲノム編集 / TALEN / 遺伝子ターゲッティング
研究概要	葉緑体は二酸化炭素同化をおこなう重要な細胞小器官であり、糖、アミノ酸および脂質代謝に欠かせない場である。また核ゲノムとならび、遺伝子導入を行える重要な標的ゲノムでもある。ところが、葉緑体ゲノムへの遺伝子導入技術は、モデル植物であるタバコを除いて、イネなどの主要農作物については実用化に至っていないのが現状である。そこで、本研究ではゲノム遺伝子を自在に改変するゲノム編集技術を応用し、いまだ汎用的な技術に至らないイネ葉緑体ゲノムへの遺伝子導入法を確立することを目指す。 H25年度において得られた成果は以下のとおりである。１．タバコおよびイネにおけるイソロイシン-tRNA(trnI)遺伝子とアラニン-tRNA(trnA)遺伝子間配列を標的とした遺伝子ターゲッティングコンストラクトを構築した。タバコについては、さらにメチオニン-tRNA遺伝子/グリシン-tRNA遺伝子連結配列(trnfM / trnG)およびバリン-tRNAコード遺伝子/リポソームタンパク質遺伝子連結配列(trnV / rps12)を標的とした遺伝子ターゲッティングコンストラクトを構築した。２．trnI / trnA遺伝子間配列、trnfM / trnG遺伝子間配列およびtrnV / rps12遺伝子間配列をそれぞれ標的とするTALENをデザイン・合成した。３．trnfM / trnG遺伝子連結配列を標的とするTALENに対して、葉緑体以降シグナルを連結し、タバコに導入し葉緑体において発現することを明らかにした。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由当初の計画では、ジーンガンを利用した遺伝子導入法により、遺伝子ターゲッティング実験を行う予定であったが、代表者が年度途中に転出し、転出先機関においてジーンガンが利用できないため、代替法による遺伝子導入を確立中であり、遺伝子ターゲッティング実験は遅れている。標的を切断する人工制限酵素の作製については、当初の予定通り進んでいる。
今後の研究の推進方策	（１）人工制限酵素を用いた高頻度ジーンターゲッティングジーンガン法に変わる方法として、プロトプラストを利用したエレクトロポレーション法を用いて遺伝子ターゲッティング実験を進める。またTALENを同時発現する実験系を試み、効率化への影響を精査する。（２）人工制限酵素を用いたホモプラストミック化技術の確立 TALEN 切断後の野生型 cpDNA の構造変化を解析し、TALEN による切断を行いさらに遺伝子変換を進めるか、切断を行わず薬剤選抜のみにより野生型 cpDNA を排除するか決定する。最終的に組換え型 cpDNA からなるホモプラストミック化の最適な条件を絞り込んでいく。
次年度の研究費の使用計画	旅費使用に関して、当初予定していた国際学会参加について取りやめとなったため、また年度末に開催された国内学会参加に関して旅費執行がH26年度に行われることになり、その差額について次年度使用額が生じることとなった。年度末に行われた国内学会参加費および旅費については、その執行が次年度になった。また、次年度に開催が決定された国際学会への参加が決定し、その参加費と旅費に使用する。