| 研究課題/領域番号 |
25450006
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| 研究機関 | 大阪教育大学 |
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研究代表者 |
向井 康比己 大阪教育大学, 教育学部, 教授 (30110795)
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| 研究分担者 |
鈴木 剛 大阪教育大学, 教育学部, 教授 (10314444)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ラン科植物 / エピジェネティック / CENH3 / GISH / ヒストン修飾 / BACクローン / 動原体 / メチル化 |
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| 研究実績の概要 |
ゲノムの倍加には、セントロメアに特異的なヒストン（CENH3）やセントロメアDNAの構造が関係していると思われたので、このことに重点をおいて研究を進めた。昨年度決定したフウランのCENH3遺伝子のアミノ酸配列から、そのペプチド抗体を作製した。抗体は免疫染色により、正しくフウラン染色体上のセントロメア領域に結合したので、染色体マーカーとして用いることができる。抗体が結合した部分を免疫沈降法でDNAごと回収し、動原体特異的塩基配列であると考えられるDNA断片を得た。
エピジェネティックな状態のDNA解析に関しては、まずDoritaenopsis Hatsuyuki ‘Nagoriyuki’をモデルとしてクロマチンの状態とヒストン修飾について調べた。この植物はDoritisとPhalaenopsisとの人工雑種であり、前者を1ゲノム、後者を2ゲノムもつ3倍体である。5mC抗体による免疫染色実験から、前者のゲノムがよりメチル化していた。3次元解析からは、核内において両ゲノムの区画化がみられ、Doritisゲノムは核の外側または片側に偏在していた。ヘテロクロマチン領域を検出するヒストン修飾抗体H3K9me2のシグナルは核の周辺部に多くみられ、ユークロマチン領域を検出するH3K27me3のシグナルは核の中心部や仁形成にみられた。
昨年度作製したフウランとリンコスチリスのBACライブラリーから、FISH法で染色体マーカーに使えるクローンを選抜した。単一のシグナルを示すクローンは得られなかったが、テロメア側、介在部あるいはセントロメア特異的にシグナルを呈するクローンは得ることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度当初の計画と比べて、染色体動原体の解析とBACライブラリーの作製に重点をおいて研究を進めてきた。この2点の研究が予想以上に進展し、本研究の意外な展開となっている。そのため、年度当初の計画の一部についてはやや遅れているが、研究全体としては概ね順調に進展しているといってよい。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究は引き続きセントロメアの解析を中心に進めていく予定である。免疫沈降法で得たDNA断片をクローニングし、そのクローンをプローブとして用いたFISH法でそれが動原体DNAと結合するか確認しなければならない。
ラン科植物では根の本数が少なくしかも成長が遅いので、実験材料である根端分裂細胞があまり取れない。免疫染色に適した良好な染色体像を如何に多く得るかがこの研究重要なポイントである。そのため、ラン栽培業者から実験に適した植物を随時購入しなければならない。免疫染色においては、固定した植物材料を保存できないので、新鮮な組織を使わなければならなかった。しかし、染色体標本を作製した後バッファー中で2週間程度保存できることがわかったので、この方法を取り入れて研究を進めたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
フウランのセントロメア抗体の作成および精製がそれぞれ一回でうまくいったので、費用が数10万円節約できた。一方で、リンコスチルスのセントロメア抗体の配列情報の確定に至らなかったので、その抗体作成が次年度にずれ込んだ。また、国際会議の参加費や旅費の支払いが精算払いになったので、それらの費用が次年度繰越になった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究の方向がセントロメア解析とクロマチンの動態の解明に発展したので、これらの研究に必要な消耗品やヒストン修飾に関する関する抗体等の薬品購入に充てる。また、実験材料も購入した方が効率がよいので、その費用に充てる。
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