| 研究課題/領域番号 |
25450058
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
海道 真典 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (20314247)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 植物ウイルス / 移行タンパク質 / 宿主因子 / 複製酵素複合体 / 輸送経路 / カルビンーベンソン回路 |
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| 研究概要 |
affinity精製と質量分析によって、Red clover necrotic mosaic virus（RCNMV）移行タンパク質（MP）と相互作用する宿主タンパク質として同定されたNicotiana. benthamiana植物のGAPDH-Aタンパク質は、RCNMVの細胞間移行に関与する宿主因子である。
今年度の研究で、GAPDH-AとRCNMV MPが植物細胞内で相互作用することがBiFCアッセイによって確認できた。当初の予想通り、葉緑体局在性のGAPDH-Aは、ウイルス感染によって表層小胞体膜に形成されるウイルス複製酵素複合体（cortical VRC）においてMPと相互作用することが確認できた。さらに大腸菌で発現させて精製したGSTとMPおよびGSTとRCNMV複製酵素タンパク質p27と、GAPDH-Aタンパク質が直接相互作用することがGST pull downアッセイによって確認できた。また、GAPDH-A遺伝子をサイレンシングした植物ではRCNMV MPがcortical VRCに局在できず、そのためMPがウイルスRNAを捕捉出来ず、ウイルスの細胞間移行が抑制されるというモデルを提示し、論文投稿中である。
GAPDH-Aの他にMPと相互作用する因子として同定されたGermin-like proteinについて、これをクローニングし、発現抑制植物を作製して調べたところ、RCNMVの細胞間移行に関与する宿主因子であることが明らかとなった。現在MPとの相互作用と細胞内局在について解析を進めている。
またRCNMV MPのプラズモデスマータへの輸送経路解明のために、各種阻害剤やドミナントネガティブ型タンパク質発現系を利用した解析を行い、これまでに膜輸送系はMPのPD輸送に関与しないことを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画でMPとGAPDH-AのBiFCアッセイは計画していなかったが、試したところ免疫沈降よりも遙かにクリアな結果を得ることが出来た。GAPDH-A以外の宿主因子の解析はGLP以外は進行していないが、GLPが細胞間移行に関与することが明らかとなったので、これについての解析を先行して行っている。また移行タンパク質輸送経路の解析と移行タンパク質の機能ドメイン解析も進行中である。さらに新たにMPと相互作用する宿主因子タンパク質を単離すべく、共免疫沈降を行うべく、以前とは異なるタグ配列を付加した移行タンパク質を発現するウイルスを用いて予備実験で良好な結果を得ており、計画は概ね順調に進行していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
GAPDH-AとGLPという2つの移行関連宿主因子を幸いに単離出来たが、このときの免疫沈降は不純物の混入が多く、更なる解析を進めるには信頼性に乏しいと考えており、新たに二段階精製免疫沈降を行う予定である。今回利用するタグ配列は前回とは異なりHis-FLAGを移行タンパク質のC末端に繋ぐ方法で、予備実験で非常に良好な結果を得ており、期待できる。
GAPDH-Aの細胞間移行における機能解析をさらに進める予定で、これに対する抗体を作製する。さらにGAPDH-BやGAPDH-Cのクローニングを行い、これらに対する抗体を作製する。細胞内でGAPDH-AとBは葉緑体内でヘテロ4量体の複合体を形成することが知られているが、RCNMVの複製複合体においても同様にGAPDH-AとBの相互作用がMPを含む複合体形成に関連するのではないかという作業仮説を立てており、この可能性について検証したい。
またMPの細胞内輸送経路の解明と平行してMPの機能ドメインの解析を進行しており、輸送経路に乗るために必要な領域を明らかにし、これらと輸送関連宿主タンパク質との相互作用について解析を進める予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
BiFCアッセイが成功したため、行う予定にしていた免疫沈降を行う必要が無くなったため、また全般的に計画が順調に進行したため、物品費が当初の予想より少なくなったため。
本年度新たに免疫沈降によってウイルス移行タンパク質と相互作用する宿主因子の同定を計画しており、また質量分析結果の解析と意見交換のため徳島大学疾患酵素学研究センターへ出張を入れる可能性が高く、これらのために繰り越し金を使用する予定である。
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