| 研究課題/領域番号 |
25450066
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 独立行政法人農業生物資源研究所 |
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研究代表者 |
菅野 正治 独立行政法人農業生物資源研究所, 耐病性作物研究開発ユニット, 主任研究員 (60242111)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | タンパク質リン酸化 / 病害抵抗性 / イネ |
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| 研究概要 |
平成25年度には、BSR1上のすべてのチロシン残基にアミノ酸置換変異（アラニンまたはフェニルアラニン）を導入し、組換え体タンパク質のスレオニンおよびチロシン自己リン酸化活性を調べた。残念ながら、スレオニン自己リン酸化活性に影響せずに、チロシン自己リン酸化活性を低下させるような変異は得られなかった。今後、自己リン酸化されたBSR1タンパク質をトリプシンで分解後、LC-MS/MSで解析し、自己リン酸化されるアミノ酸残基を決定する予定である。
N末端にmycタグを付加したBSR1 (myc::BSR1)を過剰発現するカルスを作製し、抗myc抗体でmyc::BSR1を免疫沈降した。myc::BSR1の自己リン酸化状態を調べたところ、スレオニン残基にもチロシン残基にも殆んどリン酸化が見られなかった。また、in vitro リン酸化活性もほとんど検出されなかった。
上記のmyc::BSR1過剰発現カルスをキチンエリシターで処理し、上記と同様にmyc::BSR1を免疫沈降した。myc::BSR1の自己リン酸化状態を調べたところ、スレオニン残基にもチロシン残基にも殆んどリン酸化が見られなかった。キチンエリシター以外に、いもち病菌の抽出液や、植物の病害抵抗性応答に関与することが知られている植物ホルモン（サリチル酸、ジャスモン酸、エチレン）でmyc::BSR1過剰発現カルスを処理したが、いずれの場合にも自己リン酸化の向上は見られなかった。植物ホルモン処理では、in vitro リン酸化活性の向上も見られなかった。
タンパク質リン酸化活性が消失するような変異を導入した変異型BSR1を過剰発現するイネを作製し、十分量の種子を確保した。また、BSR1過剰発現イネにサリチル酸分解酵素発現イネを交配し、後代の種子を確保した。平成26年度には、これらの種子を用いて病害抵抗性検定を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
変異型BSR1を過剰発現するイネの作製やBSR1過剰発現イネとサリチル酸分解酵素発現イネの交配は予定通り進み、次年度以降に病害抵抗性検定を行うのに十分な量の種子が確保出来た。
しかしながら、myc::BSR1過剰発現カルスを用いた実験では、キチンエリシター、いもち病菌抽出液、植物ホルモン処理を行ったが、BSR1の自己リン酸化やin vitro リン酸化活性を検出することが出来なかった。mycタグの位置がタンパク質の活性に影響を与える可能性があるので、平成26年度はC末端にmycタグを付加したBSR1を過剰発現したカルスを新たに作製し、BSR1::mycのBSR1の自己リン酸化やin vitro リン酸化活性を調べる予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度以降は、変異型BSR1を過剰発現するイネの種子やBSR1過剰発現イネとサリチル酸分解酵素発現イネの交配の後代種子を用いて、いもち病や白葉枯病の検定を行う予定である。これらの実験を通して、BSR1のタンパク質リン酸化活性の病害抵抗性への関与の有無や、BSR1による病害抵抗性へのサリチル酸の関与の有無を明らかにする。また、BSR1過剰発現イネとWRKY45発現抑制イネおよびOsNPR1発現抑制イネとの交配を行い、BSR1による病害抵抗性にWRKY45やOsNPR1が関与するか否かを明らかにする。
平成25年度は、BSR1のN末端にmycタグを付加して過剰発現させたカルスを用いたが、平成26年度はC末端にmycタグを付加したBSR1を過剰発現したカルスを新たに作製し、BSR1::mycのBSR1の自己リン酸化やin vitro リン酸化活性を調べる。また、キチンエリシター、いもち病菌抽出液、植物ホルモン処理が効果を示さない場合には、白葉枯病菌の抽出液の効果を調べる予定である。更に、自己リン酸化されたBSR1タンパク質をトリプシンで分解後、LC-MS/MSで解析し、自己リン酸化されるアミノ酸残基を決定する予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成25年度にmyc::BSR1過剰発現カルスからmyc::BSR1を免疫沈降して解析したところ、当初の予想とは異なり、自己リン酸化や in vitro タンパク質リン酸化活性を示さなかった。このため、当初の計画では平成25年度に購入を予定していた、免疫沈降実験用の試薬の一部が不要になった。
平成26年度に、新たにBSR1::myc過剰発現カルスを作製し、免疫沈降実験やBSR1::mycの生化学的解析を行うことを計画している。従って、平成26年度に免疫沈降実験に必要な試薬を購入する予定であり、上記78,046円を使用する予定である。
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