| 研究課題/領域番号 |
25450090
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
吹谷 智 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 講師 (10370157)
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| 研究分担者 |
小椋 義俊 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 助教 (40363585)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ランダム変異導入 / Bifidobacterium longum / 転移因子 / プロモーター / INSeq法 / 腸内生存 / 定着因子 |
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| 研究概要 |
平成25年度は，次世代シークエンサーを用いて変異株集団中の各変異株の同定と菌数の変化を測定する方法であるINSeq法に適したランダム変異導入法をビフィズス菌で確立するため，以下の1～3の実験を進めた．
1. Bifidobacterium longum 105-A株の完全ゲノム配列の決定：長鎖DNA配列の決定が可能な次世代シークエンサーPacBio RSIIを用いて，B. longum 105-A株のゲノム配列解析を行った．配列データのアセンブルを行い，過去に我々が決定したドラフトゲノム配列との統合により，完全長ゲノム配列を決定した．ゲノムサイズは約2.3 Mbp, 1,878 ORFが同定された．
2. ランダム変異導入ベクターの構築：転移因子TLS143のIR（転移に必要な逆位反復配列）を薬剤耐性遺伝子の両端に付加し，転移領域を構築した．転移領域を温度感受性複製ベクターpKO403に挿入し，プロトタイプとなるベクターpBFS37を構築した．また，既知の恒常発現プロモーターPgapをORF上流に挿入したTLS143の転移酵素遺伝子の発現カセットを構築し，pBFS37にクローニングを試みたが，転移酵素遺伝子の変異が頻出したことから，大腸菌内での転移酵素の発現が問題と考えられた．
3. 大腸菌で低活性かつB. longumで高活性を示すビフィズス菌プロモーターの探索：2の問題は，大腸菌で活性が低いプロモーターを用いることで解決できる．一方ビフィズス菌内では，転移酵素の発現量を高くできる高発現型プロモーターが，効率の良い変異導入に望ましい．これら両方の性質を示すプロモーターを探索するため，α-galactosidase活性を指標としたレポーターアッセイ系を構築し，ビフィズス菌由来のプロモーターの評価を行った．結果として，好適な性質を示す3種類のプロモーターを同定できた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
転移酵素を発現するのに必要なプロモーターについて，予定外の検討が必要となったが，ランダム変異導入に好適な性質を示すプロモーター3種を同定することができた．また，新たな実験系としてレポーターアッセイの系を確立できたことは，本研究の今後の展開にとって有益であると考える．さらに，計画以上の成果として，INSeq法による変異部位の網羅的な同定に必須であるB. longum 105-A株の完全ゲノム配列を決定することが出来た．これらの進捗を考えると，今年度の研究はおおむね順調に推移していると判断できる．
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| 今後の研究の推進方策 |
INSeq法の確立を目標として，まず平成25年度に同定したプロモーターを用いて，TLS143の転移酵素遺伝子の発現系を構築し，ランダム変異導入用ベクターを完成させる．これを用いてB. longum 105-A株へのランダム変異導入を試みる．導入に成功した場合は，INSeq法に使用できるように，制限酵素MmeIの認識部位をTLS143の逆位反復配列領域に導入し，再度転移の検証を行う．
これらの確立がうまく進行しなかった場合は，転移因子として様々な生物種で機能することが知られているmariner型トランスポゾンを使用して，ランダム変異導入系の構築を進めていく．転移因子の変更が必要となった場合でも，これまでに構築してきたシャトルベクターや転移酵素発現に適したプロモーターを応用できるので，迅速に対応できるものと考えられる．
また，B. longum 105-A株のマウスへの投与条件について，検討を進めていく予定である．コンベンショナルマウスへの投与試験が優先されるが，同株はヒト糞便からの単離株であるため，コンベンショナルマウスへの同株の定着率が低いことも予想される．そのため，無菌マウスを使用することも視野に入れている．
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成26年3月31日までに納品を完了し、支出は同年5月31日までの予定のため.
日水GAM Brothおよびｽｸﾛｰｽ GR500gを平成26年3月に納品完了済み，同年4月に支出の予定．
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