| 研究課題/領域番号 |
25450091
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 茨城大学 |
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研究代表者 |
長南 茂 茨城大学, 農学部, 准教授 (70312775)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | コエンザイムA / アセチル-CoA / パントテン酸キナーゼ / 有用物質生産 / 大腸菌 |
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| 研究概要 |
コエンザイムA（CoA）は生体内代謝において炭素のキャリアとして機能している。この補酵素はビタミンB5であるパントテン酸から５段階の酵素反応で生合成されるが、初発反応を触媒する酵素、すなわちパントテン酸キナーゼ（CoaA）がCoA生合成経路の鍵となっている。微生物由来CoaAには３種類あり、パントテン酸をリン酸化してホスホパントテン酸を生成するという触媒作用においては同じであるが、それぞれの性質は異なる。そこで本研究では、３種のCoaAを用いてCoA生合成経路を強化し、細胞内CoAおよびアセチル-CoAを増産、炭素代謝を活性化させ、有用物質生産に応用できる大腸菌（Escherichia coli）の育種を目標とした。
E. coli由来、Staphylococcus aureus由来、およびPseudomonas putida由来の３種類のCoaA遺伝子をPCRを用いて増幅し、それぞれを高コピー数プラスミドのpUC118および低コピー数プラスミドのpSTV28のlacプロモーターの下流に連結した。大腸菌の形質転換体をグルコースを含むLB培地で培養した結果、細胞内CoaA活性はすべての形質転換体で上昇していることが確認された。しかしながら、細胞内CoA濃度の上昇はわずかであった。そこで、出発物質であるパントテン酸を10mMの濃度で培地に添加したところ、細胞内CoA濃度は顕著に上昇し、P. putida由来CoaA遺伝子を保持する大腸菌ではおよそ３倍になった。CoA分子種の組成を解析した結果、炭素骨格の供給に重要な分子種であるアセチル-CoAが全体の約90%占めており、CoaAによってCoA生合成経路が強化されることが示された。この結果を基に、平成26年度は作成された遺伝子組換え体を用いて、CoA増産のための培養条件、そして有用物質生産への応用研究を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度は、原核生物にある３種のパントテン酸キナーゼ（CoaA）、すなわち原核I型CoaA（Escherichia coli由来）、原核II型CoaA（Staphylococcus aureus由来）、および原核III型CoaA（Pseudomonas putida由来）を用いて、組換え大腸菌の細胞内CoAの増産を目指した。前記のCoaA遺伝子を保持する組換え大腸菌ではいずれもCoaA活性が上昇し、CoaAが細胞内で機能していることを確認した。CoaA活性に上昇に伴う代謝生産物であるCoAの細胞内農度の上昇も同時に観察された。また、細胞内CoA増産の有用性を確認するため、平成26年度後半から行う予定であったアセチル-CoAからエタノールを生成するCoA依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（AdhE）のクローニングにも前倒しして着手し、本酵素の発現プラスミドも構築した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度の研究結果を基に、平成26年度は細胞内CoA増産のための培養条件を精査し、CoA依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（AdhE）あるいはアセチル-CoAを利用する酵素を用いて、CoaAによる細胞内CoA増産の有用性を評価する。具体的には、大腸菌内でCoaAとAdhE（あるいクエン酸合成酵素など）を共発現させ、細胞内CoA濃度および代謝産物を解析する。また、今年度行う予定でったゲノムDNA上に外来CoaAを保持する大腸菌の作出、およびアセチル-CoAからマロニル-CoAへ変換するアセチル-CoAカルボキシラーゼの発現プラスミドの構築にも着手する予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当初予定より若干安価に済ませることができたため、千円単位の端数が生じた。
平成26年度実施分の支払請求額とともに、当初計画どおりに使用する。
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