研究課題
基盤研究(C)
私たちは、大腸菌外膜リポタンパク質の選別輸送に関わる分子シャペロンLolAの構造・機能を解析する過程で、その変異体の一つが、Rcsリン酸リレー系に依存してlolA遺伝子自身の転写を活性化することを発見した。この新知見から、「Rcsリン酸リレー系のシグナル入力に関わる外膜リポタンパク質RcsFは、外膜に輸送された後ではなく、輸送途上で内膜上に滞留したものが内膜上RcsCDキナーゼを活性化する」、すなわち、「RcsFはリポタンパク質の外膜への輸送状況をモニターするセンサーとして働いている」のではないかと考えた。この仮説の当否を検証するため、細胞内局在部位を変化させたRcsFタンパク質を作製したところ、ペリプラズムに遊離したもの、内膜に脂質でアンカーしたもの、シグナルペプチドが切断されず内膜にアンカーしたもの、いずれの場合でも、Rcs系の活性化が観察されることから、内膜上のRcsFはRcsCDキナーゼの活性化を行うことが示唆された。実際に、内膜に脂質アンカーしているRcsFタンパク質がRcsCDキナーゼと物理的に相互作用するかどうかをin vivoでの光架橋実験で検証するために、光反応性アミノ酸ベンゾイルフェニルアラニンをRcsFタンパク質の特定の部位に導入するためのrcsF変異体シリーズを作成した。また、光架橋産物を生成するためのタグを付加したものも作成し、野生型と同様に機能することも確認し、これらの変異体を用いて、光架橋の予備的解析を行った。
2: おおむね順調に進展している
所属施設の改修工事の遅れから、放射性アミノ酸を用いたパルスーチェイス実験が十分にできなかったが、RcsFタンパク質の局在変異体の作成と表現型の解析を行い、内膜上に滞留しているRcsFタンパク質の重要性を確認できた。また、in vivo 光架橋実験の準備と予備的解析等はおおむね予定通り進行している。
当初の予定通り、光架橋実験によるRcsFとRcsCDキナーゼを含む内膜上の因子との相互作用を実証することを中心として進めていく。in vivoでの光架橋実験で、RcsFタンパク質と新規の因子との相互作用が認められた場合には、その光架橋産物を精製し、その架橋パートナータンパク質を、質量分析により同定することを目指す。さらに、抗体の作成等行い、そのタンパク質の性質を明らかにする。これまでに変異体を作成を完了し、架橋実験を行うことを予定している光反応性アミノ酸導入部位で、RcsFタンパク質と特異的相互作用するタンパク質が同定できい場合には、RcsFタンパク質の詳細な機能領域地図を作成することにより、ほかのシグナリング因子との相互作用する領域を推測する。さらに、その領域に光反応性アミノ酸を導入して光架橋実験を行うことも検討する。また、前年度十分にできなかったパルスーチェイス実験についても実施する。
所属研究施設の改修工事の遅れにより、当初予定していた放射性同位体を用いた実験等行うことができず、それらの実験に充当することを予定していた予算を十分に消化することができなかったため。２５年度に実施できなかった実験については、今年度速やか実施する予定であり、繰越分はそのために充当する。
すべて 2013
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件)
Journal of Bacteriology
巻: 196 ページ: 1167-1178
10.1128/JB.02202-12
