研究課題
本研究は、我が国の代表的産業微生物であり、様々なタンパク質を細胞外に大量に生産することが知られている麹菌（Aspergillus oryzae）のプロセッシングプロテアーゼの基質タンパク質の pull-down による捕捉、同定法を確立し、KexA、および、KexB にプロセッシングされるタンパク質を同定することを目的として行った。KexB の C 末端側領域に存在する膜貫通領域を除き、pull-down 用の FLAG-tag、精製用の His-tag を C 末端に付加した KexB をコードする遺伝子を高発現する A. oryzae 株を作製した。作製した高発現株の培養上清、並びに菌体内可溶性画分に抗 FLAG-tag 抗体を用いた免疫ブロットおよび、活性測定により KexB の発現を確認した。そこで、様々な精製方法により精製を試みたが、必要酵素量の精製には至らなかったことから、麹菌 KexB の比活性が酵母のそれと比較して非常に高いことが示された。抗 FLAG-tag 抗体を用いて菌体内可溶性画分の pull-down を行い、得られた沈殿画分を回収し、trypsin 処理の後MALDI TOF-MS での質量分析に供し、データベースに照合した。その結果、３つのタンパク質の同定に成功し、それらは転写に関するタンパク質、液胞のポリリン酸蓄積に関与するタンパク質であることを明らかにした。一方、KexA も KexB と同様のコンストラクトで麹菌を宿主としてタンパク質発現を行ったが、タンパク質の発現が見られなかった。また、活性測定によっても KexA の発現は確認ができなかった。そこで、KexA を同じコンストラクトにより大腸菌で発現させることとし、大腸菌での発現、並びにその精製に成功した。KexA 破壊株を用いた基質タンパク質の同定を継続している。
すべて 2016
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件)
Biosci Biotechnol Biochem
巻: 印刷中 ページ: 印刷中
Appl Microbiol Biotechnol
