| 研究課題/領域番号 |
25450097
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
鈴木 一史 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (00444183)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 遺伝子発現 / small RNA / 応用微生物学 / キチナーゼ |
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| 研究概要 |
Small RNAによって細菌のキチン分解利用系（キチン分解酵素群の生産、分解産物の取り込み、分解産物の代謝）が連動して制御される新たな遺伝子発現調節機構の解明が本研究の目的である。今回、以下の研究結果を得ることが出来た。
Small RNA ChiX (MicM) 遺伝子の破壊株を構築し、 キトビオースなどの炭素源を用いて培養した結果、ChiXがキチナーゼ及びキトビアーゼの生産を抑制し、chiR、chiP (ybfM)、３種のキチナーゼやCBP21遺伝子の発現を抑制していることが明らかとなった。また、ChiXと相補配列をもつchiP 5’UTRによってその抑制が解除された。chiP遺伝子が存在するchiPQ (ybfMN)-ctbオペロンの機能を明らかにするため、chiP及びchiQの遺伝子破壊株を構築し、キチンオリゴ糖などを炭素源とする培地での生育状況及びキチナーゼ活性を調べたところ、ChiPについてはキチンオリゴ糖の取り込みに必要なキトポリンであることが示唆された。chiPの発現にはGlcNAcのPTS発現制御を行う転写因子NagCの関与が示唆されたため、nagC破壊株を構築し解析を行ったところ、NagCはchiP発現を抑制していることが明らかとなった。GlcNAcのPTSをコードするnagEの破壊株をGlcNAcで培養した際、全てのキチナーゼ及びCBP21、さらにはchiP, chiRの発現に影響を及ぼすことが明らかとなった。また、転写調節因子ChiRによる全てのキチナーゼ及びCBP21の発現機構解明のため、2D-DIGE解析のための野生株とchiR欠損株の培養条件とサンプリングポイントを決定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は４つの研究項目を掲げ、同時並行で研究を行っている。項目間で多少の進展速度の違いはあるが、ほぼ当初の計画通りに研究は進行している。
１の項目（ChiXのchiP 5’UTR及びchiR 5’UTRへの結合と発現調節機構の解明）では順調に目的とする遺伝子欠損株を構築することが出来、実験が順調に進んだ。２の項目（chiP発現調節機構及びchiPQ-ctbオペロンの機能）においても遺伝子欠損株構築に成功し、ChiPの基本的な機能を明らかにすることが出来た。３の項目（ChiRによるchiA、chiB、chiC、cbpの発現メカニズム）では野生株とchiR欠損株の差が明瞭に現れる培養条件を決定するまでに予想以上の時間がかかってしまったが、最終的には条件を絞ることが出来た。４の項目（真のキチナーゼ誘導物質・誘導機構の解明）では転写因子NagC遺伝子の破壊株構築が当初の予定よりも早く完了し、実験結果を得ることが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も以下の４つの研究項目を同時並行で進める。
１．ChiXのchiP 5’UTR及びchiR 5’UTRへの結合と発現制御機構の解明：ChiXとchiP 5’UTR及びchiR 5’UTRの相補配列に互いに変異を導入し、結合の有無によるchiRの発現をin vivoで確認する。さらに、RNA間相互作用による安定性の変化を調べるため、ChiX, chiP mRNA, chiR mRNAの半減期を調べる。２．chiP発現調節機構及びchiPQ-ctbオペロンの機能：chbオペロンの転写調節因子ChbRはリン酸化キトビオースと結合して活性型になると考えられている。そこで、chbR破壊株を構築してchiPの発現を調べるとともに、chiRやchiX発現への影響を調べる。３．ChiRによるchiA、chiB、chiC、cbpの発現メカニズム： 2D-DIGE解析によって得られた候補遺伝子のクローン化及び遺伝子破壊株の構築を行い、全てのキチナーゼ及びCBP21遺伝子の発現への影響を調べる。４．真のキチナーゼ誘導物質・誘導機構の解明：manXYにコードされるPTSによってもGlcNAcは取り込まれると考えられる。また、キトビオースはPTSであるChbCによって取り込まれ、リン酸化された後に脱アセチル化されていると考えられる。そこで、これらに関与する遺伝子の破壊株を構築してキチナーゼ発現の影響を調べる。
以上の研究から、キチン分解産物の取り込みからchiPQ-ctbの発現、ChiXの結合、chiRの発現を経て、キチナーゼ及びCBP21が生産されるまでのキチン分解利用系の制御機構を明らかにする。
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