研究課題
本研究では，好熱菌を宿主としたDNAライブラリーの構築ならびにその高温活性スクリーニングを通じた耐熱性酵素遺伝子の探索を目的とした。平成25年度では，好熱菌Geobacillus kaustophilusの制限修飾系を網羅的に破壊した派生株MK244を作製した。本株は外来DNAを高効率で受容するため，汎用的なライブラリー宿主として利用できた。他好熱菌のゲノムライブラリーを，MK244を宿主として構築し，ウラシル生合成遺伝子を活性スクリーニングしたところ，好熱菌pyrF遺伝子を効率よく同定できた。本結果は，MK244株が好熱菌遺伝子スクリーニングに実用的であることを示す。さらにMK244を宿主として耐熱性糖分解酵素の遺伝子スクリーニングを行ったが，得られた陽性クローンは挿入DNA断片を欠失していた。これはプラスミド（pUCG18T）の不安定性が原因と考え，平成26年度では新たな宿主ベクター系の開発に取り組んだ。その結果，新たな薬剤耐性マーカーやプラスミドの創出に成功し，またライブラリー化ではなく限定遺伝子の細胞内機能性評価のための宿主としてMK244が利用できないかを検討するために，多糖分解性好熱菌OS27を単離した。平成27年度では，OS27株の糖分解酵素遺伝子をMK244に導入し，その活性スクリーニングを行った。それと同時にOS27の遺伝子改変にも取り組み，本菌は非常に安定かつ高コピーにプラスミドpUCG18Tを維持することを見出した。本結果は，OS27とpUCG18Tがライブラリー構築のための優れた宿主ベクター系であることを示唆しており，今後の有用酵素遺伝子の探索における新たな可能性が拓かれたといえる。ただしOS27を汎用的宿主にするには，DNA導入を容易にする工夫が必要であり，よって今後はOS27の制限修飾系を破壊した派生株の構築が，本研究の達成に有効と考えられる。
研究室ホームページhttp://www.bio.tottori-u.ac.jp/~kino1/
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