化学合成生物の細胞内共生菌の分離培養

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25450122
• 研究機関: 国立研究開発法人海洋研究開発機構
• 研究代表者: 能木 裕一 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 海洋生命理工学研究開発センター, 技術副主幹 (70399559)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 共生菌 / ハオリムシ

研究実績の概要

本研究の目的は、今まで分離・培養できなかったハオリムシ（深海生物）の細胞内共生微生物を分離・培養する事である。また、その分離・培養手法を用いて難培養微生物を単離する事である。
ハオリムシの共生菌を細胞内から単離する方法は微弱電流を用いた方法が有効である事が分かった。また、純粋分離のためには前処理として抗生物質と70％アルコールでハオリムシ表面に付着した菌を殺菌する事が重要である事も分かっていた。それにより分離した菌から抽出したDNAの16S rRNA解析は分離時に確認した共生菌の16S rRNAと同一であることが確認できた。
本年度は昨年度からの続きとして培養条件の検討を行った。しかし、分離時点では生存試験により生きていることが確認できていた菌の多くは増殖能が低下していた。前処理によりハオリムシ細胞内の菌も表面に近い菌の殺菌以外にもかなり影響を与えている事が予想された。前処理の時間と抗生物質濃度がその後の菌の増殖に大きく影響していることが分かり、これらの方法を見直した。サガミハオリムシから純粋分離した細胞内共生菌を各種培地、培養条件にて至適培養条件の検討を行った。その結果、高濃度血清添加培地で炭酸ガス濃度、硫化水素濃度、酸素濃度が培養条件に重要であることが分かった。また、前処理法を変えた為に細胞外の共生菌が幾つか分離できた。これらは分離した菌から抽出したDNAの16S rRNA解析により2新属新種、1新種と推定された。
現在、新鮮なハオリムシが入手困難な状況にあり、冷凍保存してあるサンプルを使用している。ハオリムシの冷凍保存サンプルは新鮮な生育個体に比べ生存共生菌量が大幅に少ない。そのため、単離できる生きた共生菌の量が減っている。条件設定に使用できる量が限られるため今後の進行に影響が出ている。また、細胞外共生菌の培養は成功しているので同定作業を行う。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本年度の研究計画はハオリムシの細胞内から単離した共生菌の安定した培養条件を検討する事であった。現在、ハオリムシ細胞内共生菌を生きたまま、それ以外の菌を除菌する事は成功している。しかし共生菌以外の除去条件が厳しいとその後の共生菌の増殖に大きく影響する事が分かった。このため分離株の安定した培養条件はさらに検討が必要である。ある程度の必要条件は得られてきているが、まだ更なる検討が必要である。また、新鮮なハオリムシが手に入らないため培養条件の検討には制限が掛かっている。以上により計画はやや遅れて進行している。また、細胞外の共生菌については培養に成功しており新属として同定試験を行っている。

今後の研究の推進方策

細胞内共生菌の単離法と増殖させる方法の一部まではできているので、当初の計画通り引き続き培養法の検討を行う。
新鮮なハオリムシが入手困難なため、冷凍保存してあるサンプルを使用する。そのため、単離できる共生菌の量は減るが安定した培養条件の確立を最重要課題でとして研究を進める。
細胞外の共生菌の培養法は確立できたので、新属の同定試験を行う。

次年度使用額が生じた理由

初年度、計画していた培養装置の一部を開始前に別予算で購入したため、その部分が繰り越されているが、その他の予算は計画通りに使用している。また、研究計画に遅れが出ており、必要な培養実験は行えているが、現段階では培養条件が確定できていないので、新たな培養装置一式の購入を見送った。

次年度使用額の使用計画

菌の培養条件が確定ししだい、安定培養するために培養装置一式を購入する。また、前年度からの残りの経費で分離菌株の培養に使用する培地成分や同定等の試薬を購入する予定である。また、これまでの成果の学会発表等を計画している。