| 研究課題/領域番号 |
25450131
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
湯浅 恵造 徳島大学, ソシオテクノサイエンス研究部, 准教授 (70363132)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 情報伝達 |
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| 研究概要 |
CDKファミリーの一つであるPCTK3は、その発現パターンから細胞周期制御以外の生理機能を発揮することが推測されているが、未だ生理機能解明には至っていない。これまでにPCTK3の活性化因子としてcyclin Aを同定したが、その活性はCDK2と比較して弱い活性しか示さなかった。そこで、新たな活性化因子の探索を行ったが、cyclin F、Oを含めて活性化因子は同定できなかった。一方、CDKはリン酸化によっても活性調節を受けることが知られている。アミノ酸配列解析の結果、PCTK3にはPKAのコンセンサスリン酸化配列(RRXS/T)が4か所存在することが判明した。そこで、PKAによるPCTK3のリン酸化とその生理意義について検討した。forskolin処理により内在性PCTK3はリン酸化され、その活性が上昇することが明らかとなった。また、in vitro kinase assayにより、PKAによるPCTK3のリン酸化部位を3箇所(Ser-12, Ser-66, Ser-109)同定した。さらに、擬似リン酸化変異体であるPCTK3 S12D変異体は、cyclin A2非存在下においても活性を示し、cyclin A2存在下においてはCDK2に匹敵する高い活性を示した。加えて、PCTK3ノックダウンによってHEK293T細胞の形態が変化（細胞伸展）することを見い出した。phalloidinを用いた蛍光染色の結果、PCTK3ノックダウン細胞では細胞膜辺縁でのアクチンの凝集が観察され、さらに、アクチン脱重合因子であるコフィリンのSer-3のリン酸化が増加することを明らかにした。以上の結果から、PCTK3はcyclin A2とPKAの双方による活性調節を受けていることが明らかとなり、さらにアクチン動態の調節に関与することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
第一の目的であるPCTK3の活性調節機構の詳細について解明できたことから、おおむね順調に進展していると考えられる。PCTK3はcyclin A2の結合とPKAのリン酸化によりCDK2に匹敵する高い活性を示したことから、これら因子による活性化は生理的意義があると考えられる。基質タンパク質の同定には至らなかったが、候補タンパク質を見い出しており、今後、更なる解析を行う予定である。また、ノックダウン解析により、PCTK3の生理機能解明の糸口となるような結果も得ている。これまでPCTK3の活性化因子が同定されておらず、その生理機能解明に至っていなかったが、本年度成果を基にその解明が進展するものと期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
ノックダウン解析によりPCTK3が細胞骨格制御や細胞の運動性に関与していることが示された。そこで、実際に細胞運動に関与するのか否か検討し、関与した場合、その詳細な機序について検討していく。特に、PCTK3がどのような経路でcofilinのリン酸化・脱リン酸化に関与するのか検討する。これに関連して、細胞骨格制御や細胞運動性に関わることが報告されているタンパク質をPCTK3がリン酸化することを既に見い出しており、リン酸化部位の同定を行った後、そのリン酸化がどのような生理的意義があるのか検討していく。また、PCTK3結合タンパク質として同定した14-3-3タンパク質や新たに同定した結合タンパク質との結合による細胞内シグナル伝達経路への影響についても検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当初、ペプチドアレイを用いて基質特異性のプロファイリングを行う予定であったが、別の研究テーマでペプチドアレイが使い勝手が悪いことが判明したため、本年度の研究費の一部を次年度へ繰り越すことになった。
次年度では、本年度に同定した基質候補に焦点を当て解析を行っていく予定で、その解析に繰越し分を利用する予定である。
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