| 研究課題/領域番号 |
25450133
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
郷田 秀一郎 長崎大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (00346587)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 孔形成毒素 / 変異体 |
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| 研究概要 |
膜孔形成毒素であるナマコの一種グミ由来溶血性毒素CEL-IIIは、赤血球を認識し、膜孔を形成することによって溶血活性を示す。膜孔形成は多量体化を伴って起こるが、その構造変化については知られていない。申請者の所属する研究室ではCEL-IIIの通常の溶液状態での単量体での立体構造と膜孔形成時の多量体構造をX線結晶構造解析によって明らかとしている。単量体の立体構造解析からCEL-IIIには糖を認識するドメイン１，２及び多量体化に関与するドメイン３があることが明らかとなっている。また、多量体化には、まず細胞表面を認識した後にプレポア構造と呼ばれる、膜孔形成中間体が存在することが示唆されている。そこで、CEL-IIIの膜貫通部位に変異を導入することによってプレポア構造の解明を試みた。まず始めにドメイン間の相互作用が溶血活性に与える影響を解明するため、同部位への変異導入の影響を解析した。変異の導入は、プライマーを用いたPCRによって行い、変異体の作成に成功した。変異体は大腸菌を宿主に用いた組換えタンパク質として生産した。得られたタンパク質を用いた赤血球溶血活性測定の結果、変異の導入により溶血活性が大きく影響されることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
変異体を作成することによる溶血活性と構造変化の関係を明らかにすることを目的に研究を行っている。本研究を始めるにあたって、まず糖結合ドメインと多量体形成ドメイン間のアミノ酸に着目し、その変異体の作成、溶血活性の測定を行った。本年度は変異体の作成に成功し、溶血活性との関係の解析を行った。このことによって、プレポア構造を解明する変異体の作成へと着実に進展している。現時点では、多くの変異体を作成したわけではないが、安定して変異体を作成することが確認できたため、おおむね順調であると考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
溶血活性の発現に必要な多量体化における構造変化の中間体の存在の確認のために、すでに得られている多量体構造から膜孔形成部位に存在するアミノ酸を同定する。それらの部位に変異を導入することによって、膜孔形成中間体構造を明らかとしていく。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
恒温振とう培養器を購入予定であったが、ファーメンターを使用することによって大量のタンパク質の調製が可能であったため、購入を取りやめた。しかしながら、それ以上に遺伝子工学実験用試薬及び培養用試薬代がかかり、結果として小額が残り、次年度使用することとした。
次年度も遺伝子工学実験用試薬及び培養用試薬代が当初の予定より超過する可能性が高いため、そのために使用する。
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