|
歯周病菌のプロリルトリぺプチジルペプチダーゼ（PTP）は歯肉コラーゲンの分解に重要な酵素であることから、PTPに特異的な阻害剤が歯周病の治療薬となると考えられる。そのため、PTPに特異的に阻害する物質を求めスクリーニングの結果米ぬか抽出物に高いPTP阻害活性を見出した。米ぬか抽出物より硫安分画、疎水およびイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過により精製した。SDS-PAGEから分子量は約25kDaと推定した。この阻害物質はPTPに拮抗阻害するが、他のプロリン特異性ペプチダーゼ（プロリルオリゴペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ４、プロリルアミノペプチダーゼ）にはほとんど阻害を示さなかった。一方、阻害剤のP. gingivalisの生育に対する影響を調べた結果、ＰＴＰ阻害剤が存在すると生育できないことが分かった。25Ｋタンパク質をSDS-PAGEゲルから抽出し、トリプシン分解の後TOF-MSによるアミノ酸配列決定を行い、米データベースからＳＯＤ様タンパク質（Os05ｇ0323900）が得られた。アミノ酸配列を基にcDNAを合成し、最初pET-23dをベクターとし発現を試みたが可溶性区分に殆ど見られなかった。そのため、pET32aベクターを用い、チオレドキシン(Trx) との融合タンパク質(His6タグ付き)として大腸菌で発現させた。不溶性タンパク質が主であったが、可溶性区分をNi-アガロースで精製，濃縮し組換えタンパク質（Trx-25K)を得ることができた。この融合タンパク質がP. gingivalisのPTP活性を阻害するが、Trxは阻害しないことを確認した。次いでこの組換えタンパク質の結晶化を行った結果、PEG-1000を用いた沈殿剤で菱面体晶の結晶が得られた。
|
