| 研究課題/領域番号 |
25450158
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 関東学院大学 |
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研究代表者 |
近藤 陽一 関東学院大学, 理工学部, 助教 (00391954)
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| 研究分担者 |
光田 展隆 独立行政法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (80450667)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 転写因子 / Py-Imポリアミド / シロイヌナズナ / CRES-T |
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| 研究概要 |
本研究ではDNA配列を任意に選択して結合出来るPy-Imポリアミドを利用し、遺伝子組換えと同等かつ遺伝しない有用な形質を植物にもたらす化合物の合成システムの開発を目指している。平成25年度では、合成した化合物について、酵母を利用して評価を行う系を構築した。具体的にはPy-Imポリアミドが結合する調節配列を導入した酵母に、調節配列に結合する転写因子をコードする遺伝子を形質転換し、当該の転写因子の活性によりレポーター遺伝子の発現を促進する系の構築を試みた。この系では、Py-Imポリアミドの添加により、化合物が調節配列に結合することで当該の転写因子の結合を阻害し、レポーター遺伝子の発現が低下することが期待される。既知の調節配列と転写因子の組み合わせ及び、幾つかのレポーター遺伝子を利用して、目的の系の構築を試みた。その結果、2種類の調節配列と転写因子の組み合わせで、抗真菌抗生物質オーレオバシジンA（AbA）を分解する酵素の遺伝子をレポーターとした系の構築に成功した。これらの系では、酵母に導入した転写因子によりレポーター遺伝子の発現が活性化されていることが確認できた。加えて、MYB46プロモーター配列に結合するPy-Imポリアミドの合成にも成功した。
また明確な表現型を示すシロイヌナズナのCRES-T系統を利用し、このCRES-T系統中のキメラタンパク質が結合する配列をChipシークエンシング法により単離することも目指している。この配列に結合するPy-Imポリアミドを野生型に添加することで、元のCRES-T系統と同一の表現型を誘導する可能性を検討するためである。そこで種子にタンパク質を高蓄積するCRES-T系統の表現型の原因となっている転写因子について、結合する調節配列の決定を行うため、この転写因子のORFをクローニングした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の予定では、平成25年度内に酵母のワンハイブリッド系を利用したPy-Imポリアミドの結合判定系を構築し、実際にPy-Imポリアミドの結合能の評価を行うはずだった。判定系は予定通り、複数の調節配列と転写因子の組み合わせ及び、レポーター遺伝子を利用して、構築することができた。しかしながら、構築した系を利用してPy-Imの評価を実施するまでには至らなかった。この最大の理由は、Py-Imポリアミドの合成に予想以上に手間取ったことである。特に当初予定していたSOC1第1イントロンに結合するPy-Imポリアミドの合成に時間を要してしまった。そこでMYB46プロモーターに結合するPy-Imポリアミドの合成を優先した結果、平成25年度以内の合成に成功した。
また現在、Chipシークエンシング解析による調節配列の決定を行うために、CRES-T系統の表現型の原因となっている転写因子とGFPとの融合タンパク質を過剰発現する系統を作成しているが、植物用過剰発現ベクターの構築にかなり手間取っている。幾つかの検討の結果から、この原因は当該の転写因子の導入により、大腸菌の成育が何らかの影響を受けることであると推測している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度以降は、まず合成したPy-Imポリアミドを構築した系に添加し、化合物の調節配列への結合能の評価を行っていく予定である。合成に成功したPy-Imポリアミドは、当初予定していたSOC1第1イントロンに結合するものではないが、今後の植物を実際に用いた検証には、このPy-Imポリアミドを用いていく。これは平成25年度に実施された研究で、Py-Imポリアミドが結合するターゲット配列によっては、合成に手間取ることが解ったためであり、合成が比較的容易なターゲット配列に結合するPy-Imポリアミドを優先的に利用することで、研究の進展に繋げていきたい。これらを踏まえた上で、当初の予定である評価の済んだPy-Imポリアミドについて、添加によって野生型の表現型にどのような影響を与えるか評価していく予定である。
また大腸菌の成育に影響を与えている可能性のある転写因子とGFPとの融合コンストラクトの作成に注力し、可能な限り早く融合タンパク質を過剰発現する系統の作成を行う。作成した系統を用いて、Chipシークエンシング解析を行う予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
理由も含めて現在までの達成度に記載したが、予定よりも研究の進捗が遅れている。このため本来平成25年度中に行うはずだった実験について、翌年度に持ち越している実験が幾つかある。特に合成に成功したPy-Imポリアミドの調節配列への結合能の評価を行う実験と、Chipシークエンシングに関する実験（解析準備は行うことができた）を行えていない点が大きく、その分使用額が予定よりも少なくなっている。
初期実験には十分な量のPy-Imポリアミドの合成には成功しているので、本来平成25年度に行う予定であったPy-Imポリアミドの調節配列への結合能の評価実験を行う。また作成に手間取っている未知の調節配列に結合する転写因子とGFPとの融合タンパク質過剰発現系統の作成が完了し次第、Chipシークエンシングを行い、調節配列の抽出を行う予定である。加えて当初の予定通り、野生型の植物を培地上で生育させ、合成し、評価の済んだPy-Imポリアミドを適量含んだ培地上に移植することにより、期待される表現型が誘導されるか確認を行っていく。
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