甘味タンパク質の構造と呈味発現、苦味抑制機構の解析

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25450167
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 桝田 哲哉 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (80311744)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: taste / sweetness / bitterness / X-ray crystallography / thaumatin / atomic resolution / room temperature / radiation damage

研究実績の概要

近年肥満、糖尿病をはじめとする生活習慣病が社会問題となっており、ショ糖に代替できる甘味料が切望されている。甘味タンパク質ソーマチンはショ等に比べモル比で１０万倍と非常に強い甘味を呈するノンカロリー甘味料であるが、甘味発現に必須な構造的特性については未だ明らかとなっておらず、高分解能Ｘ線解析を行うことで水素原子を含めた詳細な構造特性を明らかにし、甘味受容体との相互作用の知見を統合することで新規な甘味料の創出に繋がる。また甘味タンパク質の中には、苦味や渋味を低減させる作用や風味を増強する作用など特異な性質をもつため、食品をはじめ医薬品服用時の味質向上の観点からも詳細な構造情報、相互作用情報を得る研究は意義深い。
①部位特異的変異体の作製、呈味性評価、高分解能構造解析
甘味発現に重要な残基の変異体について１Å程度の分解能データの取得に成功した。また正方晶結晶のみならず斜方晶結晶の構造解析を進め、多角的な解析を行った。本年度の研究では、より生理的な条件下での挙動を調べるため、非凍結結晶を用いた室温での解析を行った。その結果、1.4Å程度のデータ取得に成功し、低分子化合物の相互作用部位を特定することができた。また室温測定データの特徴として、凍結結晶と比べモザイシティが小さく、側鎖の揺らぎが異なる箇所が見られ、常温でのタンパク質の有効利用を目論む上で非常に興味深い結果が得られた。またX線自由電子レーザー施設（SACLA)にて連続フェムト秒解析を行い、放射線損傷のない室温データの取得に成功した。
②苦味受容体発現細胞を用いた苦味抑制評価系の確立
前年度取得した安定発現細胞株を用いて、ソーマチンの苦味抑制機構を検討したところ、苦味抑制は甘味発現部位とは異なる部位で苦味を抑制することが明らかとなった。またこの苦味抑制作用は他の低分子甘味物質には見られなかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

放射光での高分解能室温データの取得には、様々な条件検討が必要であると目論み、本年度に条件検討の整備ができればと目論んでいたが、予想以上に大型放射光施設での実験時間を確保でき測定条件のみならず、低分子化合物をソーキングしたデータも取得できた点は大いに進展したと考えられる。またX線自由電子レーザー施設（SACLA)にて連続フェムト秒解析を行うに際し、大量の試料が必要であったが、グリースマトリックス法を導入することにより、放射線損傷のない室温データの取得に成功した。

今後の研究の推進方策

甘味発現部位に係る構造の特異性、苦味抑制機構の解明を凍結および非凍結結晶を用いた構造比較、さらには放射線損傷のないXFELとの構造比較を進め、構造生物学的見地からの検討をさらに進める。2015年度は既に大型放射光施設から本研究を含む複数の課題を採択されており、2014年度同様に実験を遂行できるものと考えられる。既に構造決定した構造はPDBに登録を行っているが、引き続き現在精密化中の構造についても順次登録を進め、論文投稿を行う。

次年度使用額が生じた理由

次年度に繰り越し、額の大きい消耗品を購入するため。

次年度使用額の使用計画

6円分を次年度のガラスキャピラリの購入に充足する。

研究成果

• [雑誌論文] Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. (2015)
  • 著者名/発表者名: Sugahara, M., Mizohata, E., Nango, E., Suzuki, M., .Tanaka, T., Masuda, T., Tanaka, R., Shimamura, T., Tanaka, Y., Suno, C., Ihara, K., Pan, D., Kakinouchi, K., Sugiyama, S., Murata, M., Inoue, T., Tono, K., Song, C., Park, J., Kameshima, T., Hatsui, T., Joti, Y., Yabashi, M., and Iwata1, So.
  • 雑誌名: Nature Methods 巻: １２ ページ: ６１－６３
  • DOI: 10.1038/nmeth.3172.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Atomic structure of recombinant thaumatin II reveals flexible conformations in two residues critical for sweetness and three consecutive glycine residues. (2014)
  • 著者名/発表者名: Masuda, T., Mikami, B., and Tani, F.
  • 雑誌名: Biochimie 巻: 106 ページ: 33-38
  • DOI: doi: 10.1016/j.biochi.2014.07.016
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] 甘味タンパク質ソーマチンの連続フェムト秒結晶構造解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 桝田 哲哉、南後 恵理子、菅原 道泰、鈴木 守、登野 健介、城地 保昌、亀島 敬、Park Jaehyun、Song Changyong、初井 宇記、矢橋 牧名、大久保 喬平、三上 文三、北畠 直文、谷 史人、岩田 想
  • 学会等名: 日本農芸化学会
  • 発表場所: 岡山大学
  • 年月日: 2015-03-28
• [学会発表] SACLAにおけるシリアルフェムト秒Ｘ線結晶構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 田中 智之、南後 恵理子、菅原 道泰、鈴木 守、桝田 哲哉、山下 鮎美、田中 里枝、登野 健介、城地 保昌、亀島 敬、Jaehyun Park、Changyong Song、初井 宇記、矢橋 牧名、潘 東青、島村 達郎、溝端 栄一、北郷 悠、岩田 想
  • 学会等名: 日本結晶学会
  • 発表場所: 東京大学
  • 年月日: 2014-11-01 – 2014-11-03
• [学会発表] 卵白リゾチームの甘味特性 (2014)
  • 著者名/発表者名: 桝田 哲哉、北畠 直文、谷 史人
  • 学会等名: 食品酵素化学研究会
  • 発表場所: 大阪府立大学I-site難波
  • 年月日: 2014-08-30
  • 招待講演
• [学会発表] 甘味タンパク質ソーマチン Asp21 変異体の構造活性相関 (2014)
  • 著者名/発表者名: 村田 一輝、桝田 哲哉、三上 文三、谷 史人
  • 学会等名: 日本食品科学工学会
  • 発表場所: 中村学園大学
  • 年月日: 2014-08-28 – 2014-08-30
• [学会発表] 非可食部に由来する不溶性多糖類ナノファイバーの物性解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 二村 健太、阿部 賢太郎、桝田 哲哉、松宮 健太郎、南部 優子、松村 康生、矢野 浩之、谷 史人
  • 学会等名: 日本食品科学工学会
  • 発表場所: 中村学園大学
  • 年月日: 2014-08-28 – 2014-08-30
• [学会発表] XFELを用いた創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 南後 恵理子、田中 智之、鈴木 守、桝田 哲哉、山下 鮎美、田中 里枝、登野 健介、城地 保昌、亀島 敬、Jaehyun Park、Changyong Song、初井 宇記、矢橋 牧名、潘 東青、島村 達郎、溝端 栄一、北郷 悠、石谷 隆一郎、湯本 史明、岩田 想、
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: ワークピア横浜
  • 年月日: 2014-06-27
• [学会発表] Structure-sweetness relationships in the sweet-tasting protein, thaumatin (2014)
  • 著者名/発表者名: Masuda, T., Sano, A., Murata, K., Ohta, K., and Tani, F.
  • 学会等名: Food Structure Functionality Symposium
  • 発表場所: Amsterdam, The Netherlands.
  • 年月日: 2014-04-01