油脂・食品中のリスク懸念物質のin vitro動態に関する研究

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25450197
• 研究機関: 地方独立行政法人大阪市立工業研究所
• 研究代表者: 渡辺 嘉 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究主任 (60416310)
• 研究分担者: 室田 佳恵子 近畿大学, 理工学部, 准教授 (40294681) ; 佐藤 博文 地方独立行政法人大阪市立工業研究所, 生物・生活材料研究部, 研究員 (70443546)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: MCPD / 膵リパーゼ / 小腸吸収性 / Caco-2

研究実績の概要

初めに、2および3-MCPDジオレート、さらに、その分解生成物標品である2および3-MCPDモノオレートを新たに合成した。続いて2および3-MCPDモノオレートの位置異性体を分離するためのコロナ荷電化粒子検出器(CAD)を接続したHPLC分析系を新たに確立した。本検出器では、MCPDに結合した脂肪酸種に関わらず、感度が一定で、脂肪酸種毎の検量は必要ないことを当初期待したが、実際には、脂肪酸種毎に感度が異なるため検量が必要で、既存のLC-MS法と同等の分析方法であることを新たに確認できた。
本分析系で、ブタ膵臓リパーゼとパンクレアチンによる2および3-MCPDジオレート加水分解生成物を分析した。その結果、3-MCPDジエステルの1位アシル基が分解された3-MCPD-2オレートが蓄積していることを初めて確認することができた。一方、2-MCPDジエステルからの2-MCPDモノエステル蓄積量は相対的に少なく、遊離2-MCPDが蓄積していたことから、2-MCPDジエステルについては、2つのアシル基が分解除去され速やかに遊離MCPDに変換されると推定された。
次に、遊離MCPDの小腸での吸収性を、Caco-2細胞によるヒト小腸上皮モデルを用いてin vitro評価した。遊離MCPDは、腸管側から基底側へ経時的に移行し、2-と3-MCPD間に速度差は認められなかった。また、濃度依存性も確認されなかったことから、拡散により吸収されるものと推定された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Caco-2細胞によるヒト小腸上皮モデルを用いた小腸吸収性評価には、十分なn数を確保しなければならず、また、細胞の培養期間も長いことから、試験に相当な時間を要した。また、異性体分離定量のためのHPLC-CAD分析系の確立も新たな試みであり、分離条件の決定に計画以上の時間を要した。しかしながら、研究は概ね計画通りに進展させることが出来た。

今後の研究の推進方策

当初の計画では、MCPD・グリシドール類の細胞毒性評価をCaco-2細胞を用いて行う予定であったが、平成26年度までに行ったCaco-2細胞によるヒト小腸上皮モデルを用いた一連の検討の結果、毒性は比較的低く、Caco-2細胞では想定していた結果が得られない懸念が出てきた。そこで、チャイニーズハムスター繊維芽細胞V79系を用いた毒性評価試験を行うことに変更する。

また、MCPD・グリシドール類のおよび炎症性評価を行う際、Caco-2細胞単層膜の基底側にヒト単球細胞を共培養し、炎症性サイトカイン産生によるCaco-2 細胞傷害を評価する予定であった。しかし、Caco-2細胞単層膜はバリア能が期待できず、共培養する必要性は低いことが本年度の研究から推定されるため、評価手法詳細を変更する予定である。

次年度使用額が生じた理由

実験計画の一部を次年度に実施するため

次年度使用額の使用計画

培養細胞用培地、消耗品、試薬など

研究成果

• [雑誌論文] Alteration of Wax Ester Content and Composition in Euglena (2015)
  • 著者名/発表者名: Masami Nakazawa, Hiroko Andoh, Keiichiro Koyama , Yomi Watanabe et al.
  • 雑誌名: Lipids 巻: 50 ページ: 483-492
  • DOI: DOI 10.1007/s11745-015-4010-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enzymatic Analysis of Positional Distribution of Fatty Acids in Solid Fat by 1,3-Selective Transesterification with Candida antarctica Lipase B (2014)
  • 著者名/発表者名: Yomi Watanabe, Shinichi Sato, Saiko Sera, Chiemi Sato, Kazuaki Yoshinaga, Toshiharu Nagai, Ryota Sato, Hiroaki Iwasaka, Tsunehiro Aki
  • 雑誌名: J. Am. Oil Chem. Soc 巻: 91 ページ: 1323-1330
  • 査読あり
• [学会発表] Analysis of positional distribution of fatty acid in milk fat using a novel enzymatic method (2014)
  • 著者名/発表者名: Yomi Watanabe, Mihoko Asada, Jun Imagi, Katsuyoshi Saito, Akiko Sasaki, Ryo Sasaki, Shinichi Sato, Chiemi Sato, Takashi Sano, Tadahisa Shibuya, Toshiharu Nagai, Yuki Tsukahara, Ryuji Hori, Rika Homma, Yosuke Miyazaki, Atsushi Yamashita, Kazuaki Yoshinaga, Shimpei Watanabe
  • 学会等名: Active Enzyme Molecule 2014
  • 発表場所: 富山国際会議場（富山県富山市）
  • 年月日: 2014-12-18 – 2014-12-19
• [学会発表] Identification of hydrolysates of 2-, and 3-MCPD esters by pancreas lipase and estimation of their intestinal absorbability (2014)
  • 著者名/発表者名: Naoki Kaze, Hirofumi Sato, Kaeko Murota, Syun Kumamoto, Miyako Kotaniguchi, Shinichi Kitamura, Hiroshi Yamamoto, *Yomi Watanabe
  • 学会等名: 10th International Symposium on Biocatalysis and Agricultural Biotechnology
  • 発表場所: Ishou University, 高雄 (台湾)
  • 年月日: 2014-10-30
  • 招待講演
• [学会発表] 膵リパーゼによる2-および3-MCPDエステルの分解産物の同定と吸収性 (2014)
  • 著者名/発表者名: 風直樹・渡辺嘉・室田佳恵子・熊本舜・佐藤博文・小谷口美也子・山本浩志・乾博・北村進一
  • 学会等名: 第５３回日本油化学会年会
  • 発表場所: ロイトン札幌、札幌
  • 年月日: 2014-09-09
• [学会発表] New enzymatic method to determine FA composition at sn-2 of triglycerides. Results of the collaborative study. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yomi Watanabe et al.
  • 学会等名: 105th AOCS Annual Meeting and Expo
  • 発表場所: San Antonio, (Henry B. Gonzalez Convention Center) USA
  • 年月日: 2014-05-07
• [学会発表] Hydrolysis of 2-MCPD di-esters by porcine pancreas lipase (2014)
  • 著者名/発表者名: Naoki Kaze, Hirofumi Sato, Hiroshi Yamamoto, *Yomi Watanabe
  • 学会等名: 105th AOCS Annual Meeting and Expo
  • 発表場所: San Antonio, (Henry B. Gonzalez Convention Center) USA
  • 年月日: 2014-05-06