| 研究課題/領域番号 |
25450245
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
目黒 貞利 宮崎大学, 農学部, 教授 (50112321)
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| 研究分担者 |
亀井 一郎 宮崎大学, 農学部, 准教授 (90526526)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | シイタケ / 子実体形成 / 形質転換 / プロトプラスト |
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| 研究実績の概要 |
（１）形質転換系の確立
シイタケの子実体形成メカニズムを解明するために、特定遺伝子ノックダウンと、評価としての液体培地上での子実体形成率を組み合わせた逆遺伝学的なアプローチを可能とするために形質転換手法を確立した。プロトプラスト-PEG 法におけるプロトプラスト調製条件を検討したところ、形質転換に十分と考えられるプロトプラスト数を得ることが出来た。また、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（gpd）遺伝子プロモーターおよびターミネーターを含み、クローニングサイトとしてAsc Iサイトを持つ発現ベクターを構築した。選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子（hpt）を導入し、形質転換を行ったところ、ハイグロマイシン耐性を持つ形質転換体を複数得ることが出来た。また、それらにはクランプ結合を持つものと持たないものが存在した。すなわち、本形質転換法により、子実体形成評価可能な形質転換体を得られることが示唆された。
（２）光受容体遺伝子ノックダウンコンストラクトの構築
シイタケ子実体形成へは光照射が必須であることが分かっている。そこで既報の光受容体タンパク質がシイタケ子実体形成にどのように関わっているかを明らかにするために、シイタケ光受容体タンパク質をコードしているLe.phrA遺伝子のクローニングを行い、全長cDNAおよびゲノムDNAを得た。コード領域約600 bpを対象に、GUS部分配列をリンカーとしたRNAiコンストラクトを構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
プロトプラスト再生株に単核菌糸体が多く含まれるため、子実体形成実験可能な複核菌糸体を得るプロトプラスト調製条件の検討に時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
技術的ベースは整えることが出来た。今後は研究計画通りに複数のシイタケ子実体形成関連遺伝子のノックダウンコンストラクトを構築し、順次形質転換を進めていき、子実体形成関連遺伝子の機能を表現型レベルで詳細に明らかにする。研究を遂行する上での課題は、致死遺伝子に対する対応が予想されるが、作成するコンストラクトの対象配列を変えることでコントロールできないか検討する。
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