| 研究課題/領域番号 |
25450426
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
川口 博明 鹿児島大学, 獣医学部, 准教授 (60325777)
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| 研究分担者 |
谷本 昭英 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (10217151)
三好 宣彰 鹿児島大学, 獣医学部, 教授 (80229905)
三浦 直樹 鹿児島大学, 獣医学部, 准教授 (80508036)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 高脂肪・高コレステロール食 / マイクロミニピッグ / 動脈硬化 / NOS阻害剤 / 高コレステロール血症 / エコー |
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| 研究実績の概要 |
【目的】本課題では、我々の開発した高脂肪・高コレステロール食の8週間給餌によるマイクロミニピッグ動脈硬化モデルを利用し、臨床画像検査で確認できる程度の動脈硬化病変をより短期間に発生させ、医療機器開発用動脈硬化発症ミニブタを作出することが目的である。平成25年度は食餌制御にさらにアンジオテンシンⅡ（Ang II）投与を負荷し短期間で動脈硬化が誘発できたが、その程度は弱かった。平成26年度はさらにNOS阻害剤（L-NAME）を同期間負荷し、より明瞭で程度の強い動脈硬化病変をより短期間で発生できるかについて検証した。
【材料と方法】成獣マイクロミニピッグ雄12頭を3群に分けた。Ⅰ群には普通食給餌を、Ⅱ群には高脂肪・高コレステロール食給餌を、Ⅲ群にはさらにL-NAMEの経口反復投与を施した。試験期間を2週間とし、経時的に採血、体重測定を行った。実験終了後、麻酔下放血により安楽殺して剖検し、心臓や大動脈などの循環器系器官の採材などを行った。ホルマリン固定後の頚動脈についてエコーで動脈硬化病変を検査した。さらに、胸部・腹部大動脈にOil red O脂肪染色を施し、赤色動脈硬化病変を観察した。
【結果】L-NAME投与により高血圧が生じることは予備検討で確認した。ⅡおよびⅢ群では高コレステロール血症が誘発されたが、Ⅰ群ではみられなかった。頚動脈エコー検査では全動物に動脈硬化病変はみられなかった。胸部・腹部大動脈の観察ではⅢ群に顕著な赤色動脈硬化病変がみられ、Ⅱ群では軽度に認められ、Ⅰ群ではみられなかった。今後、赤色動脈硬化病変の面積を画像解析ソフトを用いて定量化する必要がある。
【考察】L-NAMEの方がAng IIよりも程度の強い動脈硬化病変を誘発できたが、頚動脈エコーで確認できる程度の動脈硬化病変はみられず、投与量や投与期間、それ以外の負荷する方法の検討が必要と考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本課題では、我々の開発した高脂肪・高コレステロール食の8週間給餌によるマイクロミニピッグ動脈硬化モデルを利用し、臨床画像検査で確認できる程度の動脈硬化病変をより短期間に発生させ、医療機器開発用動脈硬化発症ミニブタを作出することが目的である。
平成25年度は食餌制御にさらにアンジオテンシンⅡ投与を負荷し短期間（2週間）で動脈硬化が誘発できたが、その程度は弱かった。平成26年度はさらにNOS阻害剤（L-NAME）を同期間負荷し、より程度の強い動脈硬化病変を誘発できたがこれらの動脈硬化病変について、病理組織学的検索が必要であるが、現在、検査中である。具体的には、胸部・腹部大動脈のOil red O脂肪染色を行い、赤く染色される粥状硬化病変の面積の定量化を行っている。さらに、この粥状硬化病変について、現在、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色標本を作製中である。その他、冠状動脈を含む心臓、大脳動脈輪や脳底動脈を含む脳などの病理組織学的検索も必要であり、これらもHE染色標本を作製中である。このHE染色標本の解析の結果、組織化学的染色（マッソン・トリクローム染色やエラスチカ・ワンギーソン染色など）や免疫組織学的染色（Iba-1, HLA-DR, lysozyme: マクロファージ系、α-SMA: 平滑筋）の必要性、その他、肝臓や血管のRNALater保存材料を用いた遺伝子解析が生じることが予測される。よって、現在までの達成度としてはやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
【目的】本課題では、我々の開発した高脂肪・高コレステロール食の8週間給餌によるマイクロミニピッグ動脈硬化モデルを利用し、臨床画像検査で確認できる程度の動脈硬化病変をより短期間に発生させ、医療機器開発用動脈硬化発症ミニブタを作出することが目的である。平成25年度は食餌制御にさらにアンジオテンシンⅡ投与を負荷し短期間（2週間）で動脈硬化が誘発できたが、その程度は弱かった。平成26年度はさらにNOS阻害剤（L-NAME）を同期間負荷し、より程度の強い動脈硬化病変を誘発できたが、頚動脈エコーで確認できる程度の動脈硬化病変はみられなかった。よって、これらの試験での病理学的検査および遺伝子解析などのさらなる検討を行い、投与量や投与期間、それ以外の負荷する方法を検討し、医療機器開発用動脈硬化発症ミニブタを作出する方法を考察する必要がある。
【材料と方法】アンジオテンシンⅡ投与負荷試験、L-NAME負荷試験の２つの試験について病理学的検査（ヘマトキシリン・エオジン染色、組織化学染色：マッソン・トリクローム染色やエラスチカ・ワンギーソン染色など、免疫組織化学的染色：Iba-1、HLA-DR、Lysozyme、α-SMA）を行い、遺伝子解析の必要性を検討する。遺伝子解析が必要な場合は、肝臓や血管、消化管のRNALater保存材料を用い脂質代謝関連あるいは血管作用に関連のある遺伝子解析（LDLR cDNA, HMG-CoA還元酵素, HDLR, APOBEC-1, Hepatic Lipase, NPC1L1など）を実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
NOS阻害剤（L-NAME）負荷試験について、さらに病理組織学的検索が必要になった。しかしながら、大動脈のOil red O脂肪染色を行い、赤く染色される粥状硬化病変の面積の定量化する解析に時間が費やされている。また、病理標本作製に時間がかかっており、特に、病理標本作製に必要なガラス類や染色試薬などの予算執行が滞ってしまったことが、次年度使用額が生じた理由である。アンジオテンシンⅡ投与負荷試験も含め、総合的に遺伝子解析の必要性を検討しなければならず、2つの試験の病理評価を急ぐ必要がある。
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| 次年度使用額の使用計画 |
NOS阻害剤（L-NAME）負荷試験について2015年7月を目安に大動脈の動脈硬化病変や冠状動脈を含む心臓、大脳動脈輪や脳底動脈を含む脳などの病理標本作製を行い、病理組織学的検索を実施する。その解析の結果、組織化学的染色や免疫組織学的染色の必要性があるか判断する。さらに、アンジオテンシンⅡ投与負荷試験も含む2つの試験の病理評価を総合的に評価し、遺伝子解析の実施を検討する。
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