| 研究課題/領域番号 |
25450463
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
北村 直樹 鳥取大学, 農学部, 准教授 (80301951)
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| 研究分担者 |
澁谷 泉 鳥取大学, 農学部, 教授 (50162649)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | アクセサリーローブ / N型電位依存性Ca2+チャネル / CaV2.2 / ω-conotoxin GVIA / 鳥類 / 電気生理学 / 平衡感覚 |
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| 研究概要 |
我々は鶏アクセサリーローブ（AL）より細胞を酵素処理により単離し、パッチクランプ法を用いて、電位依存性Na+チャネルを発現した機能的なニューロンがAL中に存在すること、その興奮性がグルタミン酸やGABAにより調整されていることを明らかにしてきた。
【ALニューロンの電位依存性Ca2+チャネルの解析】(1)孵卵14～18日目の鶏胚子より酵素処理により単離した単離ALニューロンより電位依存性Ca2+チャネル電流をホールセル電位固定法により測定した。(2)ALニューロンから得られたCa2+チャネル電流は一般的なニューロンのそれと比較して振幅が非常に大きく、活性化の電位依存性は哺乳類ニューロンの高閾値型チャネルのものと相同であった。(3)N型Ca2+チャネルの抑制薬であるω-conotoxin GVIAはCa2+チャネル電流を90%近く抑制した。(4)通常、Ca2+チャネル電流は測定中に徐々にその振幅が減少していくが、ALニューロンでは全く減少せず、むしろ増大した。(5)50Hzという高頻度の脱分極パルスで刺激した場合にもCa2+チャネル電流の振幅は減衰しなかった。(6)以上の成績から、鶏ALニューロンには高密度にN型Ca2+チャネルが発現しており、シナプス終末において高頻度の活動電位に対する神経伝達物質放出に貢献している可能性が示唆された。
【ALニューロンの機械刺激受容機構の探索】(1)単離ALニューロンからオンセル電位固定法により膜電流を測定しながら、記録電極内に陽圧あるいは陰圧を加え、細胞膜の電気的活動に変化が生じるかを検討した。(2)ホールセル電位固定法により膜電流を測定しながら、ALニューロンを低浸透圧の実験液に曝し細胞容積を変化させて、細胞膜の電気的活動に変化が生じるかを検討した。(3)これまでのところ1、2いずれの処置によってもALニューロンの電気的活動に顕著な変化は見られていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
【電位依存性Caチャネルの解析】当初計画通していた実験と実験成績の解析を完了した。その成果を学術雑誌に論文を投稿し査読を受け、掲載決定の通知を受けた。(Y. Suzuki et AL., 2014, J Comp Physiol A)
【機械刺激受容機構の探索】計画立案当初に予想していた結果は今のところ得られていない。計画を立案し、申請した時点では正立顕微鏡を購入し、脊髄のスライス標本を用いて、AL組織に外部より機械的な刺激を加え、その反応を個々の細胞から記録することを計画していた。配分された予算額の都合上、正立顕微鏡を購入することは困難なので、単離したALニューロンを用いた実験に限って実施していく計画に変更した。今後、実験装置の再調整や実験条件を見直すことで、機械刺激受容機構が確認できることを期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
【AL特有の電位依存性Ca2+チャネル分子の同定と機能解析】(1)ALニューロンのCa2+チャネル電流には、その振幅が測定中に全く減弱しないという特異な性質が見られた。そこで、この特異な性質を担っている機構を解明することにした。(2)鶏ALと背根神経節よりcDNAライブラリを作成し、N型電位依存性Ca2+チャネルに特異的なプライマーセットを用いてRT-PCRを行う。得られたPCRプロダクトの塩基配列を決定し、ALニューロンにおける特異的なスプライスバリアントの有無を確認する。(3)スプライスバリアントが見付かった場合には、その分子をHEK293に発現し、ALニューロンのCa2+チャネル電流の再構成を試みる。(4)スプライスバリアントが見付からなかった場合には、Ca2+チャネルのアクセサリーサブユニットや相互作用のある分子の探索を行う。(5)一連の研究により、新たなCa2+チャネルの活性化調節機構が見出される可能性がある。
【機械刺激受容機構の探索】(1)単離ALニューロンに機械的刺激、浸透圧刺激などを加えて、機械刺激受容機構の解明を引き続き行う。(2)細胞を灌流する装置を改良し、より速く液交換ができるようにしたり、パッチ電極を介した細胞膜への圧力の添加をより速く正確に行えるようしたりして、機械刺激受容機構の探索を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
交付申請書提出時点で計画していた北米での国際学会への演題登録を中止し、当初予定していた旅費を支出しなかったため、その分が次年度繰越となった。その他の変更点は、購入予定であった正立顕微鏡を配分予算額の関係上、温度コントローラーに変更したことのみであり、概ね計画通りに執行した。
試薬、実験器具、実験動物などの消耗品費として使用する。
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