| 研究課題/領域番号 |
25450465
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
浅野 淳 鳥取大学, 農学部, 准教授 (90312404)
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| 研究分担者 |
山野 好章 鳥取大学, 農学部, 教授 (00182593)
竹内 崇師 鳥取大学, 農学部, 准教授 (10325061)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 精子形成 / ホメオドメインタンパク質 |
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| 研究概要 |
１．精巣におけるNkx2-6発現細胞の同定
ホメオドメインタンパク質Nkx2-6と、Nkx2-6と相同性の高いNkx2-3, Nkx2-4およびNkx2-5について、マウス組織における遺伝子発現をRT-PCR法を用いて調べた。その結果、Nkx2-6 mRNAは精巣に発現していたものの、その他の組織については検出されなかった。一方、Nkx2-3 mRNAは脾臓および胸腺で発現がみられたが、その他の組織では検出されなかった。またNkx2-4 mRNAは脾臓および骨格筋でそれぞれ強い発現が見られた一方、それ以外の組織の発現は弱いことがわかった。また、Nkx2-5 mRNAは、解析したすべての組織で同程度の弱い発現が観察された。さらに、抗Nkx2-6抗体とマウス精巣切片を用いた免疫染色を行った。その結果、ステージI~VIIの精細管において、伸長精子細胞の細胞質内および核内にシグナルがみられた。一方、精巣上体内の精子は染色されなかった。
２．Nkx2-6の予想結合配列を有する遺伝子上流域の検索
ホメオボックスタンパク質の結合DNA配列の網羅的解析（Berger, M.F. et al., Cell 2008）によって明らかにされた、Nkx2-4/2-6のDNA結合モチーフ配列を1 kb以内の上流域に有するマウス遺伝子を、転写調節配列解析ツールRSATを用いて検索した。また、遺伝子発現解析データベースGEOを用いて、精原細胞と比較して精子細胞にて３倍以上mRNA発現が上昇しているマウス遺伝子を検索した。その結果、34個の遺伝子がこれら２つの条件にともに合致していた。このうち、雄性生殖細胞に発現していることが報告されている4遺伝子（Prm1, Akap3, Txndc8, Cylc2)について、約1 kbの遺伝子上流域をクローニングした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２５年度に予定されていた研究計画の一つは、「精巣におけるNkx2-4/2-6の発現細胞の同定と比較」であった。マウス精巣におけるNkx2ファミリー遺伝子の発現解析を実施し、Nkx2-4, Nkx2-5、Nkx2-6がマウス精巣で発現していることが示唆された。Nkx2-6は精巣で強い発現が見られたので、本年度はNkx2-6の発現解析を中心に実施した。Nkx2－６についてはマウス精巣における発現細胞を同定した。以上の点より、「精巣におけるNkx2-4/2-6の発現細胞の同定と比較」についてはおおむね計画通りに進捗していると考えられる。
また本年度に予定されていたもう一つの計画は「Nkx2-4/2-6によって転写制御される遺伝子の予測」であった。これについても、データベース検索を通じて、候補となる遺伝子を列挙し、そのうち4遺伝子の遺伝子上流域をクローニングしたので、おおむね計画通りに進捗していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
精巣におけるNkx2-4およびNkx2-5の発現については、NKx2-6と同様に免疫染色を実施し、必要に応じてin situハイブリダイゼーション解析を行う。この際、市販の切片・抗体などを適宜利用し、研究遂行を円滑に進める。
本年度にクローニングした4遺伝子の上流域を用いて、当初の計画に従いレポータージーンアッセイを行う。Nkx2-4, Nkx2-5, Nkx2-6のそれぞれが結合すると予測されるDNA配列はほぼ共通しているので、これらのNkx2ファミリーの発現ベクターを利用して、レポーター活性に対する影響を解析する。さらに、クロマチン免疫沈降法を行い、マウス精巣のゲノムDNAと抗体を用いてクロマチン免疫沈降法を行った後、回収されたマウス精巣のゲノムDNA断片を鋳型としてPCR法を行い、候補遺伝子の転写調節領域が増幅されるかどうか解析する。以上の解析により、in vivoの精巣において候補遺伝子の転写調節領域にNkx2-4, Nkx2-5, Nkx2-6タンパク質が結合しているかどうかを解析する。
Nkx2-6タンパク質は伸長精子細胞に発現することが示唆された。伸長精子細胞では核の凝縮がおこり、転写活性が低下していると考えられている。したがってNkx2-6はクロマチン構造の変化を促し、転写を抑制する因子として機能している可能性がある。この点については、精子細胞のクロマチン凝縮に関連するタンパク質(TP1, TP2, プロタミンなど）との相互作用があるかどうか、免疫沈降法などを用いた検討が今後必要であると考えられる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
計画では２６年度に物品費として２０万円を計上したが、予備実験において予定した時期よりも早い段階で実験結果が得られたことから、当初計画した消耗品を購入する必要が無くなった為である。
２６年度と同様に、２７年度においても酵素等の物品費として使用する。
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