| 研究課題/領域番号 |
25450493
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 独立行政法人農業生物資源研究所 |
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研究代表者 |
後藤 洋子 独立行政法人農業生物資源研究所, 新機能素材研究開発ユニット, 上級研究員 (00391574)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 絹タンパク質 / 細胞培養足場基材 / 血管内皮細胞 / 化学修飾 / 糖鎖 |
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| 研究概要 |
絹タンパク質由来の組織再生用材料として血管内皮細胞培養用足場基材を開発することを目的に、今年度は血管内皮細胞が認識・結合すると考えられる糖残基を化学修飾した絹フィブロインの作製を行った。先ず繭のアルカリ水溶液高温処理によって得られた絹フィブロイン繊維を中性塩の水溶液に溶解・脱塩して、原料の絹フィブロイン水溶液を調製した。次に、細胞認識糖残基を持つオリゴ糖由来の修飾剤の合成を行い、これを絹フィブロイン水溶液に加え反応させることで目的の糖鎖修飾絹フィブロインを合成した。なお、糖鎖修飾絹フィブロインと未反応の修飾剤との分離・精製は、透析と限外ろ過によって行った。
得られた糖鎖修飾絹フィブロインは糖鎖由来の黄色着色とともに、原料の絹フィブロインと異なる紫外可視吸収スペクトルを示した。また、修飾絹フィブロインと原料の絹フィブロインの核磁気共鳴（NMR）スペクトルの測定を行ったところ、修飾絹フィブロインのスペクトルにおいては絹フィブロインのスペクトルでは観測されない糖鎖に由来するピークが新たに現れ、目的糖鎖が導入されたことが確認できた。さらに原料のオリゴ糖と絹フィブロインの混合物のNMRスペクトルの測定を行い、糖鎖修飾絹フィブロインと混合物の各スペクトルにおける絹フィブロインのアミノ酸残基由来のピーク積分値と糖鎖由来のピーク積分値を比較した。その結果、糖鎖修飾絹フィブロインにおいては糖鎖含有量が約15重量％であることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
修飾剤と絹フィブロインとの反応条件を検討した結果、糖鎖修飾絹フィブロインの合成方法が確立し、効率的に糖鎖修飾絹フィブロインを得ることが可能になった。加えて、次年度の研究の一部は、これまでに作製した糖鎖修飾絹フィブロインを用いて実施することができる。
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| 今後の研究の推進方策 |
糖鎖修飾絹フィブロインにおける導入糖鎖の細胞認識部位としての機能発現を事前検証するため、細胞の代わりに導入糖残基を特異的に認識して結合すると考えられるレクチンを用いて、水溶液中での糖鎖修飾絹フィブロインに対する結合・凝集反応を行う。凝集反応は紫外可視分光光度計を用いて検出する。
一方、糖鎖修飾絹フィブロイン水溶液を用いて組織培養用プレートをコーティングすることで、細胞培養足場基材の作製を行う。当初細胞培養用カバーガラスを基板に用いて足場基材を作製する予定であったが、ガラス表面は負に荷電しており、修飾絹フィブロインのコーティング後もこの負荷電が細胞の接着や増殖に及ぼす影響が考えられるため、基板を親水処理されたポリスチレン製の組織培養用プレートに変更して足場基材の作製を行う。そして、糖鎖修飾絹フィブロインコート培養プレートにおいて血管内皮細胞のモデル細胞の培養を行い、糖鎖修飾絹フィブロインコート培養プレートに対する細胞接着性を調べる予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度は原料試薬費を必要とする糖鎖修飾絹フィブロインの合成実験が中心であったが、一部既存の原料試薬を使用して実験を行ったため、消耗品費に残金が生じた。
次年度交付される研究費は、当初の予定どうり原料のオリゴ糖をはじめレクチン凝集反応を行うための試薬や、分光光度計用ミクロセル、細胞培養用足場基材作製に用いるプラスチック製品などの消耗品購入に充てる予定である。
一方、研究推進のため研究計画の一部を前倒しして実施するので、次年度消耗品費として確保している予算の一部と今年度研究費の残金を合わせて、受託試験による細胞培養実験実施のための役務費に充てる予定である。
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