| 研究課題/領域番号 |
25460033
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
上田 卓見 東京大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (20451859)
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| 研究分担者 |
嶋田 一夫 東京大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (70196476)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 蛋白質 / 薬学 / 構造生物学 / シグナル伝達 / NMR |
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| 研究概要 |
b2ARを昆虫細胞発現系で大量発現して、精製した上で、rHDLに再構成した。ゲルろ過の溶出体積が、rHDLのStokes径約10 nmに相当したことから、rHDLを形成していることが確認できた。また、SDS-PAGE解析およびRI標識リガンド結合アッセイより、培地1Lあたり100 ugのb2ARを含むb2AR-rHDLを、90 %以上の精製度および80%以上の活性割合で調製できたことが明らかとなった。
また、b2AR-rHDLに、フォルモテロール、Gsタンパク質および35S-GTPgSを添加した上で、Gタンパク質結合型35S-GTPgSを検出した結果、逆アゴニストであるカルベジロール存在下よりも有意に増大したことから、b2AR-rHDLがGタンパク質活性化能を保持していることが示された。
次に、調製したb2AR-rHDLを用いて、完全アゴニストであるフォルモテロール存在下において、GRK2によるリン酸化反応を行った。反応液をSDS-PAGE解析した上でPro-Q DiamondおよびSYPRO-Rubyによる染色を行った結果から、b2AR1分子に2個または3個のリン酸基が付加されていることが示された。一方、MAPキナーゼ活性化のみを誘起し、インターナリゼーションを誘起しないことが知られているカルベジロール存在下でリン酸化反応を行った際には、付加したリン酸基の数は約1個であった。
さらに、15N-Ser, Thr標識リン酸化b2AR-rHDLを調製して、NMRスペクトルを測定した。その結果、b2ARの運動性の高い領域(N末端、C末端、ICL3)に存在するSerおよびThr残基の数に対応する、18個のシグナルが観測された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り、b2AR-rHDLの調製およびb2AR-rHDLを用いた、Gタンパク質活性化およびGRK2によるリン酸化の解析方法を確立して、構造解析を行う条件におけるリガンドバイアスの解析が可能となった。さらに、リン酸化を受けると考えられるC末端領域に由来するNMRシグナルを観測することに成功した。これらのシグナルを帰属して、リン酸化を受ける残基の特定およびリン酸化やエフェクター結合に伴う構造変化の解析が可能となると考えられる。したがって、研究は順調に進行していると考えた。
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| 今後の研究の推進方策 |
各リガンド結合状態における、b2ARのNMRスペクトルを取得して、比較する。b2ARには、活性化と対応した構造変化をするメチオニン残基M82, M211, M279が存在し、M211, M279はG蛋白質やGRK, b-アレスチンが結合する細胞内領域の近傍に存在することを考慮して、メチオニン残基の側鎖メチル基を観測する。加えて、C末端領域のSer, Thr残基の観測も行う。変異体を用いて、各リガンド結合状態のNMRシグナルを帰属した上で、温度依存性や化学交換の解析により、バイアスを有するリガンドが結合した状態におけるb2ARの構造平衡を解析する。平衡が示唆されるようなシグナルが観測された場合は、温度依存性とシミュレーションにより、交換を解析する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
センサーチップ等の、表面プラズモン共鳴法によるb2ARとアレスチンの相互作用解析に用いる試薬の納入が、今年度中に完了しなかったため。
2013年度から繰り越した予算に関しては、2014年度に表面プラズモン共鳴法によるb2ARとアレスチンの相互作用解析を行って、使用する。
当初から2014年度に使用する予定であった予算に関しては、当初の計画通りに実験を行い、使用する。
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