副腎皮質病態解析のためのtargeted steroidomics研究

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25460042
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 東北薬科大学
• 研究代表者: 山下 幸和 東北薬科大学, 薬学部, 教授 (80382670)
• 研究分担者: 小松 祥子 東北薬科大学, 薬学部, 助手 (00438566) ; 大野 賢一 東北薬科大学, 薬学部, 講師 (20347272) ; 加藤 創 東北薬科大学, 薬学部, 助教 (80584458)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: LC-ESI-MS法 / 副腎皮質ホルモン / 微量定量法 / プロトン親和性誘導体 / 臨床診断法 / targeted steroidomics

研究概要

18-オキソコルチゾールをLC-ESI-MS/MS法を用いて定量するための重水素標識した内標準物質の化学合成法を検討した。ビスメチレンジオキシ(BMD)基で側鎖を保護したコルチゾンを出発原料に、NaOD/MeODを用いて活性水素を重水素に置換し、ただちにMeOD/NaBD4でカルボニル基を還元した。ついで活性二酸化マンガンで3位水酸基を選択的に酸化してBMD-[2,2,4,9a,11a,12,12-D7]-コルチゾールとした。BMD-[2,2,4,9a,11a,12,12-D7]-コルチゾールをNOCl/ピリジンで処理し、重要中間体である11b-nitrite体とした。11-Nirite体を窒素気流下、Barton反応に付し18-oxime体としたのち、3工程で目的とする重水素標識した18-オキソコルチゾールを得た。質量スペクトルにより、標識された水素は9a11a、12aおよび12bの4箇所であった。一方、重要中間体である11b-nirite体を酸素気流下、Barton反応に付し18-nitro体としたのち、重水素標識した18-ヒドロキシコルチゾール-BMDを得た。合成した内標準物質を用いて、まず18-オキソコルチゾールのプロトン親和性誘導体化によるLC-ESI-MS/MS法の確立を行った。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

重水素標識していないコルチゾール-BMDを原料に数度予備実験を行い、合成ルートをシミュレーションした。標識された重水素のうち、安定な9a、11a、12aおよび12bの4箇所が残存し、Barton反応以後の反応過程で、活性水素に置換した重水素は脱離していた。重水素標識体に含まれる非標識体の割合は0.5%以下であり、LC-ESI-MS法における内標準物質として使用可能であることが、検量線の作成により判明している。重水素標識した18-ヒドロキシコルチゾール-BMDのBMD基の脱保護については、現在検討中である。

今後の研究の推進方策

18-ヒドロキシコルチゾールの内標準物質の合成が完了次第、アルドステロンを含むこれら18位が酸化されたステロイド類ならびにこれらの代謝前駆体および代謝物を含めたプロファイリングを、プロトン親和性誘導体化法を駆使して構築する。構築された手法を、副腎皮質モルモン類のtargeted steroidomicsに展開し、臨床検体測定への応用、副腎疾患の臨床診断法（原発性アルドステロン症、アジソン病、先天性副腎疾患の早期診断など）への実用化を検討する。

次年度の研究費の使用計画

旅費の支出額が予定より少なかったため。
次年度の使用計画に繰越、旅費などの支出に充当する。

研究成果

• [雑誌論文] An innovative LC-MS/MS-based method for determining CYP17 and CYP19 activity in the adipose tissue of pre- and postmenoposal and ovariectomized women using 13C-labeled steroid substrates (2014)
  • 著者名/発表者名: Toshihiko Kinoshita, Seijiro Honma, Yasuhiro Shibata, kouwa Yamashita, Yoko Watanabe, Hitoe Maekubo, Mitsunobu Okuyama, Akiko Takashima, Naoki Takeshita
  • 雑誌名: J. Clin. Endocrinol. Metab. 巻: 99 ページ: 1339-1347
  • DOI: 10.1210/jc:2013-3715
  • 査読あり
• [学会発表] LC-ESI-MS/MS法による3b-HSD活性評価を目的とした基礎検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小松祥子、榊 教克、山下幸和
  • 学会等名: 日本薬学会第134年会
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 20140329-20140329
• [学会発表] LC-ESI-MS/MS法による水酸化ステロイドのメタボローム解析(VII) ステロール類のピコリン酸およびN-メチルピペリジンカルボン酸誘導体の調製 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小松祥子、都澤 優、千葉 淳、山崎敬子、山下幸和、沼澤光輝
  • 学会等名: 第52回日本薬学会東北支部大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 20131020-20131020
• [学会発表] アンドロゲンの高感度分析法開発と唾液試料への応用 (2013)
  • 著者名/発表者名: 田村智美、長谷川智美、大野賢一、山下幸和
  • 学会等名: 第52回日本薬学会東北支部大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 20131020-20131020
• [学会発表] Microdetermination of labile estrogen-o-quinones and their cysteine conjugates by high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (2013)
  • 著者名/発表者名: Kouwa Yamashita, Miki Shiratori, Emi Kondo, Sachiko Komatsu, Hajime Katoh, Ken-ichi Ohno
  • 学会等名: The 39th International Symposium on High-Performance-Liquid-Phase Separation and Related Technique
  • 発表場所: Amsterdam, The Netherlands
  • 年月日: 20130619-20130619
• [備考] 東北薬科大学臨床分析化学教室ホームページ (発表論文）
  • URL: http://www.tohoku-pharm.ac.jp/laboratory/rinsyob/ronbun.html