| 研究課題/領域番号 |
25460051
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 武庫川女子大学 |
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研究代表者 |
松永 久美 武庫川女子大学, 薬学部, 准教授 (70271418)
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| 研究分担者 |
萩中 淳 武庫川女子大学, 薬学部, 教授 (20164759)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ハイスループット / 熱ショックタンパク質 |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、標的タンパク質（レセプター、酵素など）を固定化したアフィニティー基材を調製し、アフィニティー基材と高分離能カラムを組み合わせ、化合物ライブラリー、漢方薬などの植物由来の天然物、かびなどの生物由来の天然物中より微量の抗腫瘍活性物質をハイスループットスクリーニングし質量分析法を用いることにより、オンラインで微量の抗腫瘍活性物質の構造情報を得ることである。熱ショックタンパク質(Hsp90) を N-末端を介してアミノプロピルシリカゲルに固定化する方法として、アミノプロピルシリカゲルをグルタルアルデヒドで活性化し、Hsp90を含む溶液と振とうし、N-末端を介して固定化した。一方、Hsp90をC-末端を介してアミノプロピルシリカゲルに固定化する方法としてHsp90 を0.1 M リン酸塩緩衝液（pH 7.0）中で、1-ethyl-3-(3-methylaminopropyl)carbodiimide および N-hydroxysulfosuccinimideと反応後、アミノプロピルシリカゲルと室温で24時間反応させることにより、C-末端を介してアミノプロピルシリカゲルに固定化した。得られたそれぞれの Hsp90 固定化アミノプロピルシリカゲルを内径 5 mm 、長さ 50 mm のガラスカラムに充填し、Hsp90 (+)カラムを作成した。また、ヒドロキシルアミンを用いて、Hsp90 (-)カラムも同様に調製した。しかし、今回は、マーカー物質としてノボビオシンあるいはゲルダナマイシンを用いた Hsp90 (+)および Hsp90 (-)カラムによる天然物中の抗腫瘍活性物質をハイスループットスクリーニングする分析法の確立、活性の評価、結合能の評価および非特異的結合の評価には至っていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
固定化に用いるHsp90は高価な化合物のため、固定化の方法をしっかり確立する必要があった。そこで、Hsp90のかわりにcellobiohydrolaseを用いてプレテストを行った関係でカラムの調製が遅れた。
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| 今後の研究の推進方策 |
アミノプロピルシリカゲルと同様に、キャピラリー内壁に Hsp90 を固定化し、Hsp90 (+)キャピラリーカラムを作成する。Hsp90 (-)キャピラリーカラムも同様に作成する。得られた Hsp90 を固定化したアフィニティー基材を、フロンタルクロマトグラフィーシステムにより評価する。マーカー物質として、ノボビオシンあるいはゲルダナマイシンを用い、Hsp90 (+)および Hsp90 (-)カラム、並びに Hsp90 (+)および Hsp90 (-)キャピラリーカラムを用いることにより、活性の評価、結合能の評価および非特異的結合の評価を行う。 次に Hsp90を固定化したアフィニティー基材と高分離能カラムの組み合わせとして Hsp90 (+)カラムと内径 2 mm、長さ 15 cm の逆相系粒子充填型カラム（C18、C8カラム等）および Hsp90 (+)キャピラリーカラムと内径 100 μm、長さ 15 cm のモノリス型逆相系カラム（C18、C8カラム）あるいはグリセロールタイプの親水性の高いモノリス型逆相系カラムの組み合わせにより、分離用移動相およびその流速の最適化を検討する。化合物および天然物中より抗腫瘍活性物質をハイスループットスクリーニングし、質量分析法を用いることにより、オンラインでそれらの構造情報を得、微量の抗腫瘍活性物質の探索を行う。
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