EXiLE法と質量分析法とを用いたアレルゲンエピトープの網羅的解析技術の開発

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25460082
• 研究機関: 国立医薬品食品衛生研究所
• 研究代表者: 中村 亮介 国立医薬品食品衛生研究所, 医薬安全科学部, 室長 (50333357)
• 研究分担者: 中村 里香 国立医薬品食品衛生研究所, その他部局等, 研究員 (40643333) [辞退]
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: アレルゲン / EXiLE法 / 質量分析法 / IgE / ルシフェラーゼ / エピトープ / 抗原抗体反応

研究実績の概要

我々が開発したIgE crosslinking-induced luciferase expression（EXiLE）法は、ラット培養マスト細胞株に、ヒトの高親和性IgE受容体（FcεRI）遺伝子、および、転写因子NF-AT依存的ルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入した細胞株、RS-ATL8細胞を用いる新しいアレルギー試験法である。この細胞はヒトのFcεRIのほか、内在性のラットFcεRIを発現することから、FcεRI架橋を誘導できるとされるマウス抗卵白アルブミン（OVA）-IgEモノクローナル抗体（E-C1）と、誘導できないとされる抗OVA-IgE抗体（E-G5）によりこの細胞を感作し、液相中および固相化した加熱処理OVA抗原へのEXiLE応答を定量的に評価したところ、E-C1抗体は溶液中のOVAに強く応答し、加熱処理OVAにはさらに強く応答することが分かった。一方、E-G5抗体は溶液中のOVAには全く応答しなかったが、これを固相化すると応答が見られるようになった。この結果は、E-G5抗体のOVAとの親和性が低いために溶液中のOVAではFcεRIを架橋できず、avidityの高まった固相化抗原でのみ応答が認められたものと推察された。そこでE-C1抗体とE-G5抗体のOVAとの結合性を表面プラズモン共鳴を用いて測定したところ、予想とは異なり、両者にはほとんど違いがないことが明らかになった。そこで、非還元下のSDS-PAGEによりOVAを分離し、両抗体によるウェスタンブロッティングを行なったところ、E-C1は加熱変性した凝固体を含むすべての分子量のOVAに結合したが、E-G5はほぼ二量体に相当するOVAにのみ結合し、加熱後には結合性が著しく減弱していることが分かった。この結果は、IgEの結合性と架橋活性が全く異なる現象であることを改めて明瞭に示したものと考えられる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

脱顆粒誘導活性の異なる２種のIgEの反応性の違いを、本研究によって開発した新しい技術によって明瞭に区別することができた。また、これらの反応性の違いが親和性（affinity）の違いによるものであるかどうかを物理化学的に解析した。さらに、それらの結果とウェスタンブロッティングの結果とを総合し、両抗体のエピトープの物理化学的特性を概ね明らかにすることができた。これらの結果を通じ、IgEと抗原との結合性と架橋誘導能の違いを区別することの重要性を示すことができた。

今後の研究の推進方策

本年度までに、当初予定していた固相EXiLE法を手法的に確立することにほぼ成功した。この手法は、貴重な患者血清を節約して超高感度アレルゲン測定ができるだけでなく、抗原側の物理化学的変化をマスト細胞の応答性という生理学的なエンドポイントによって再現性高く評価できる画期的な技術となるであろうことが期待される。最終年度に当たる来年度は、人工合成ペプチド等を用いて、実際にこの手法がアレルゲンのエピトープ同定に利用できるかどうかを評価する。

次年度使用額が生じた理由

培養細胞株そのものや実験のプロトコルを改良し、アレルギー試験法としての利用法を確立するため、当初の研究計画より多くの条件検討が必要になり、研究補助員を短期採用してこれに取り組むこととしたため。

次年度使用額の使用計画

2015年４月に１名の研究補助員を採用し、培養細胞を用いたアレルギー試験法の改良と利用法の確立に関する研究業務の補助に当たらせる。

研究成果

• [雑誌論文] IKZF1, a new susceptibility gene for cold medicine-related Stevens-Johnson syndrome/toxic epidermal necrolysis with severe mucosal involvement (2015)
  • 著者名/発表者名: Ueta M, Sawai H, Sotozono C, Hitomi Y, Kaniwa N, Kim MK, Seo KY, Yoon KC, Joo CK, Kannabiran C, Wakamatsu TH, Sangwan V, Rathi V, Basu S, Ozeki T, Mushiroda T, Sugiyama E, Maekawa K, Nakamura R, Aihara M, Matsunaga K, Sekine A, Pereira Gomes JÁ, Hamuro J, Saito Y, Kubo M, Kinoshita S, Tokunaga K
  • 雑誌名: J Allergy Clin Immunol 巻: S0091-6749(14) ページ: 03744-0
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2014.12.1916
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genetic variants associated with phenytoin-related severe cutaneous adverse reactions (2014)
  • 著者名/発表者名: Chung WH, Chang WC, Lee YS, Wu YY, Yang CH, Ho HC, Chen MJ, Lin JY, Hui RC, Ho JC, Wu WM, Chen TJ, Wu T, Wu YR, Hsih MS, Tu PH, Chang CN, Hsu CN, Wu TL, Choon SE, Hsu CK, Chen DY, Liu CS, Lin CY, Kaniwa N, Saito Y, Takahashi Y, Nakamura R, et al.
  • 雑誌名: JAMA 巻: 312 ページ: 525-534
  • DOI: 10.1001/jama.2014.7859
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Independent strong association of HLA-A*02:06 and HLA-B*44:03 with cold medicine-related Stevens-Johnson syndrome with severe mucosal involvement (2014)
  • 著者名/発表者名: Ueta M, Kaniwa N, Sotozono C, Tokunaga K, Saito Y, Sawai H, Miyadera H, Sugiyama E, Maekawa K, Nakamura R, Nagato M, Aihara M, Matsunaga K, Takahashi Y, Furuya H, Muramatsu M, Ikezawa Z, Kinoshita S
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 4 ページ: 4862
  • DOI: 10.1038/srep04862
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Anaphylactic transfusion reaction in homozygous haptoglobin deficiency detected by CD203c expression on basophils (2014)
  • 著者名/発表者名: Iwamoto S, Yonekawa T, Azuma E, Fujisawa T, Nagao M, Shimada E, Nakamura R, Teshima R, Ohishi K, Toyoda H, Komada Y
  • 雑誌名: Pediatr Blood Cancer 巻: 61 ページ: 1160-1161
  • DOI: doi: 10.1002/pbc.24965
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Use of Humanised Rat Basophilic Leukaemia Cell Line RS-ATL8 for the Assessment of Allergenicity of Schistosoma mansoni Proteins (2014)
  • 著者名/発表者名: Wan D, Ludolf F, Alanine DG, Stretton O, Ali Ali E, Al-Barwary N, Wang X, Doenhoff MJ, Mari A, Fitzsimmons CM, Dunne DW, Nakamura R, Oliveira GC, Alcocer MJ, Falcone FH
  • 雑誌名: PLoS Negl Trop Dis 巻: 8 ページ: e3124
  • DOI: 10.1371/journal.pntd.0003124
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 架橋誘導活性の異なるモノクローナルIgEの抗原認識様式の違いについて (2015)
  • 著者名/発表者名: 岡本(内田)好海, 中村亮介, 相馬愛実, 石井明子, 最上知子, 川崎ナナ, 川上 浩, 手島玲子, 斎藤嘉朗
  • 学会等名: 日本薬学会第135年会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-28
• [学会発表] 口腔アレルギー症候群における新たなin vitro試験法の検討 (2015)
  • 著者名/発表者名: 秋山晴代, 河又小夏, 政岡智佳, 中村亮介, 福冨友馬, 甲斐茂美, 松藤 寛, 宮澤眞紀
  • 学会等名: 日本薬学会第135年会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-28
• [学会発表] 新規培養細胞株を用いたインフュージョン反応惹起性の評価法開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中村亮介
  • 学会等名: 平成26年度創薬基盤推進研究事業成果発表会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-02-26 – 2015-02-26
  • 招待講演
• [学会発表] EXiLE法を用いた口腔アレルギー症候群の新たなin vitro検査法の検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 秋山晴代, 河又小夏, 中村亮介, 福冨友馬, 甲斐茂美, 松藤 寛, 宮澤眞紀
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] 新規蛋白チップによる臍帯血特異的IgEの検出と、離乳完了期までに見られるIgE抗体の低親和性から高親和性への変化 (2014)
  • 著者名/発表者名: 亀村典生, 川本典生, 中村亮介, 手島玲子, 下条直樹, 深尾敏幸, 木戸 博
  • 学会等名: 第51回日本小児アレルギー学会
  • 発表場所: 四日市
  • 年月日: 2014-11-08 – 2014-11-09
• [学会発表] 「風邪薬」による重症眼粘膜障害を伴うスティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症発症に関連するHLAについて (2014)
  • 著者名/発表者名: 中村亮介, 鹿庭なほ子, 上田真由美, 外園千恵, 杉山永見子, 前川京子, 内田好海, 矢上晶子, 松倉節子, 池澤善郎, 松永佳世子, 徳永勝士, 相原道子, 木下 茂, 斎藤嘉朗
  • 学会等名: 第21回日本免疫毒性学会学術年会
  • 発表場所: 徳島
  • 年月日: 2014-09-11 – 2014-09-12
• [学会発表] 日本人のスティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症患者における重症眼粘膜障害発症に関連する医薬品の傾向 (2014)
  • 著者名/発表者名: 内田好海, 鹿庭なほ子, 上田真由美, 中村亮介, 杉山永見子, 高橋幸利, 古谷博和, 矢上晶子, 松倉節子, 池澤善郎, 松永佳世子, 外園千恵, 相原道子, 木下 茂, 斎藤嘉朗
  • 学会等名: 第21回日本免疫毒性学会学術年会
  • 発表場所: 徳島
  • 年月日: 2014-09-11 – 2014-09-12
• [学会発表] 培養細胞を用いるアレルギー試験「EXiLE法」の開発と応用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 中村亮介
  • 学会等名: 第41回日本毒性学会学術年会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2014-07-02 – 2014-07-04
  • 招待講演
• [学会発表] 臍帯血の抗原特異的低親和性IgE検出と，生後6，14ヶ月の高親和性IgEへの変化 (2014)
  • 著者名/発表者名: 木戸 博，亀村典生，中村亮介, 手島玲子，深尾敏幸
  • 学会等名: 第26回日本アレルギー学会春季臨床大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2014-05-09 – 2014-05-11
• [学会発表] Biomarkers for risk of SJS/TEN in Japanese compared to other populations (2014)
  • 著者名/発表者名: Nakamura R
  • 学会等名: Drug Information Association
  • 発表場所: メリーランド（米国）
  • 年月日: 2014-05-07 – 2014-05-09
  • 招待講演
• [学会発表] HLA association with antipyretic analgesics-induced Stevens-Johnson syndrome / toxic epidermal necrolysis with severe ocular surface complications in Japanese patients (2014)
  • 著者名/発表者名: Nakamura R, Kaniwa N, Ueta M, Sotozono C, Sugiyama E, Maekawa K, Yagami A, Matsukura S, Ikezawa Z, Matsunaga K, Tokunaga K, Aihara M, Kinoshita S Saito Y
  • 学会等名: Drug Hypersensitivity Meeting 2014
  • 発表場所: ベルン（スイス）
  • 年月日: 2014-04-09 – 2014-04-12
• [学会発表] Medication tendencies for inducing severe ocular surface symptoms in Japanese Stevens-Johnson syndrome / toxic epidermal necrolysis patients (2014)
  • 著者名/発表者名: Kaniwa N, Ueta M, Nakamura R, Sugiyama E, Maekawa K, Takahashi Y, Furuya H, Yagami A, Matsukura S, Ikezawa Z, Matsunaga K, Sotozono C, Aihara M, Kinoshita S, Yoshiro S
  • 学会等名: Drug Hypersensitivity Meeting 2014
  • 発表場所: ベルン（スイス）
  • 年月日: 2014-04-09 – 2014-04-12
• [図書] 食物アレルギーの現状とリスク低減化食品素材の開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 監修：森山達哉, 穐山 浩
  • 総ページ数: 299
  • 出版者: シーエムシー出版
• [図書] Basophils and Mast Cells (2014)
  • 著者名/発表者名: Edited by Gibbs BF and Falcone FH
  • 総ページ数: 251
  • 出版者: Humana Press