| 研究課題/領域番号 |
25460086
|
|---|
| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
|---|
研究代表者 |
熊谷 圭悟 国立感染症研究所, 細胞化学部, 主任研究官 (40443105)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | 脂質輸送 / セラミド / スフィンゴミエリン / リン酸化 / FFATモチーフ / メンブレンコンタクトサイト |
|---|
| 研究実績の概要 |
平成26年度中に重要な情報を得た。 Gehin Charlotteはヒト培養細胞において、ほぼ全てのキナーゼをカバーする700種類以上のキナーゼについてsiRNAライブラリーを用いて発現抑制させた。 その中で、発現抑制させる事によってスフィンゴミエリン量が低下するキナーゼが12種類あることを報告した。
一方、我々は本研究の申請書の中で、キナーゼに対するsiRNAライブラリーを用いてCERTのS315（CERT S315）をリン酸化するキナーゼを網羅的に探索する計画を記述していた。 現在、我々のこの計画はCharlotteらの報告によって大きな影響を受けている。 即ち、CERT S315のリン酸化はスフィンゴミエリン生合成を促進することが既に分かっており、CERT S315をリン酸化するキナーゼの発現が抑制されれば、スフィンゴミエリン量は低下することが予想される。 つまり、CERT S315をリン酸化するキナーゼがCharlotteの12種類のキナーゼの中に含まれている可能性が高いと我々は判断し、網羅的なスクリーニングに代わり、先述の12種類のキナーゼを標的として優先的に解析を進めることとした。
12種類のキナーゼ全てについて、キナーゼ１種類当り3箇所のsiRNAと１組の定量PCR用プライマーを調達した。 HeLa-S3細胞にそれぞれのキナーゼに対するsiRNAをトランスフェクションし、CERT S315のリン酸化状態を調べた。 同時にリアルタイム定量PCRを行い、これらのキナーゼのmRNA量を測定した。 多くの標的キナーゼのmRNA量が低下していたが、一部に抑制が不充分なものもあった。 実験の結果、発現を抑制してもCERT S315のリン酸化状態に変化のないものが多かったが、一部にリン酸化状態を低下させるものと、逆に亢進させるものが見出された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究実績に記述したように、発現を抑制させることによってCERT S315のリン酸化状態に変化をもたらすキナーゼが明らかになり、一応の成果を得た。 一方で、依然として課題は多い。 具体的には、標的としたキナーゼ全てについて発現を十分に抑制できた訳ではないこと、また、off-targetの可能性が否定できていないことである。 当初の計画では平成26年度にスクリーニングを行い、平成27年度以降、こうした検討項目に順次対応していく予定であった。 その点から考慮すれば、計画は順調に推移しているとも言える。
しかしながら、CERT S315のリン酸化状態の変動幅があまり大きくないことが懸念材料となっている。即ち、標的とした12種類のキナーゼの中にはCERT S315を直接リン酸化するキナーゼは含まれていない可能性がある。 スフィンゴミエリン量の変化など、二次的・三次的な影響によってCERT S315のリン酸化が変化しているのかもしれない。 そのため、現状の結果に満足することなく、代替案をバックグラウンドで準備しておく必要があると考えている。 代替案を行う場合には、再びスクリーニングの段階に戻って実験を進めなければならないので、計画が大幅に遅れる可能性をはらんでいる。
このような状況を総合的に鑑み、おおむね順調に推移していると見るには時期尚早であるとして、やや遅れているのが現状であるとの判断を下した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
現状、2つの問題点が存在している。 1つ目は、発現抑制が不充分なために評価が下せなかった標的キナーゼが存在することである。 2つ目は、siRNAによってCERT S315のリン酸化状態が変化した原因が、標的遺伝子の発現抑制によるものなのか、off-target効果によるものか明確でないことである。 そこで、平成27年度は、発現抑制が不充分であったキナーゼに対して条件の最適化を行い、１２種類全てのキナーゼについて評価を下す。 その上で、CERT S315のリン酸化状態の変動幅が十分に大きく、研究を継続するに値する評価を得た場合には、off-targetの可能性について検討する。 即ち、遺伝子を強制過剰発現させることでフェノタイプの回復が起こるか否か検討する。
ところで、通常状態におけるCERT S315のリン酸化がほとんど起きていない場合には、リン酸化を担うキナーゼの発現を抑えてもリン酸化状態の変動幅はごく小さなものになってしまう。 昨年度に記述した発現ライブラリーを使った新しいスクリーニング計画はこうした場合にも有効な手法である。 そこで、siRNAによるスクリーニングが目立った成果を出せなかった場合に備えて、内在性CERTと同レベルのCERT 10Eを発現する細胞株の樹立と、その細胞を用いたスクリーニングの条件検討を進める。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２６年度中にもたらされた重要な知見に基づき、実験計画の一部を修正した。これにより、現在、計画立案時には想起し得なかったより効率的なアプローチを採用・優先させている。そのため、当初の計画では既に購入しているべき物品の一部が、現状ではまだ使用するタイミングに至っておらず、購入を留保している状況にある。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
購入を留保している物品は、新しいアプローチが予想通りに進展した場合にはそのまま不要となるが、その場合にはやや遅れている研究を速やかに進展させるために、複数の遺伝子関連試薬の購入に当てる。 新しいアプローチが目立った研究成果を生み出さなかった場合には、別の代替案が準備中であるので、そちらに使用する。
|
