| 研究課題/領域番号 |
25460145
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| 研究機関 | 徳島文理大学 |
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研究代表者 |
野路 征昭 徳島文理大学, 薬学部, 准教授 (80271534)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | サイコサポニン生合成 / シトクロムP450 |
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| 研究実績の概要 |
ミシマサイコにおけるサイコサポニン生合成の全容を分子生物学的に解明するために、次世代シークエンサーを用いて作成したミシマサイコの根、茎、葉のESTデータベースを検索し、サイコサポニン生合成に関与する酵素の遺伝子を得ることに成功した。
これまでにオキシドスクアレンの環化酵素であるβ－アミリン合成酵素遺伝子を単離し、その機能解析を行ったが、今回、11種のミシマサイコ由来の新規シトクロムP450についてcDNAクローニングを行い、その機能を解析した。ミシマサイコ由来のβ－アミリン合成酵素遺伝子を発現させることで、サイコサポニン生合成の基質であるβ－アミリンを生産する酵母で、これらシトクロムP450を発現させ、代謝物を解析したところ、11種の候補シトクロムP450の中の1つのシトクロムP450であるR144792によるβ－アミリンの28位水酸化は確認できたが、その他の候補はβ－アミリンを基質として酸化反応を行うことはなかった。そこで、さらにESTデータベース検索を行い、新たな3種の候補シトクロムP450、Rnn13181、Rnn17705、Rnn4327のcDNAの単離し、機能解析を行ったが、これらのP450もβ－アミリンを基質とすることはなかった。β－アミリンからサイコゲニンまでの生合成は数種のシトクロムP450による逐次反応であると予想されるため、各候補シトクロムP450を組み合わせた解析を行うために、それぞれの酵素を発現させた酵母からタンパク質を抽出し、in vitroでの活性測定を試みた。しかしながら、in vitroでは酵素活性を検出することが出来なかったため、今後新たな活性測定法を試みる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は新たな3種を含む14種のミシマサイコ由来のシトクロムP450について酵母を用いた機能解析を行ったが、β－アミリンを基質とする活性をもつシトクロムP450を得ることが出来なかった。そこで、β－アミリンからサイコゲニンまでの生合成は数種のシトクロムP450による逐次反応であると考え、R144792と他の候補シトクロムP450を組み合わせた場合の反応生成物について解析するために、それぞれの酵素を発現させた酵母からタンパク質を抽出し、in vitroでの活性測定を試みたが、in vitroでは酵素活性を検出することが出来なかった。酵母からのタンパク質抽出法をいろいろと試したが、酵母内（in vivo）では活性の見られるシトクロムP450であるR144792においても、in vitroでは活性を検出することが困難であった。そのため、シトクロムP450の逐次反応を検出する方法を変更する必要があった。そのため、当初の計画からやや遅れている達成度となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
β－アミリンからサイコゲニンまでの生合成は数種のシトクロムP450による逐次反応であると考えられるため、複数のシトクロムP450を組み合わせた活性を測定する必要がある。当初は各種シトクロムP450を発現させた酵母からタンパク質を抽出し、それらを組み合わせてin vitroで機能解析を行う計画だったが、この方法は困難であることが判明したため、今後は、複数のシトクロムP450遺伝子を同一の酵母内で共発現させ、in vivoで機能解析を行う予定である。まず、β－アミリンの28位を水酸化するシトクロムP450, R144792と他のシトクロムP450という組み合わせで解析を進めていきたい。
また今年度はサイコゲニンの配糖体化酵素について、これまでに得られた2種の糖転移酵素の機能解析を大腸菌発現系を用いて行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
サイコサポニン生合成に関与すると考えれれるシトクロムP450の解析のために、当初の計画では、in vitroでの活性測定を行うためのタンパク質実験用試薬を購入する予定であったが、in vitro活性測定が困難だったため、酵母内で発現させるin vivoでの機能解析に計画を変更したため次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
酵母を用いたin vivoでの機能解析には、新たなベクターの購入が必要となるため、26,102円は消耗品代として使用する予定である。
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