| 研究課題/領域番号 |
25460172
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 帝京平成大学 |
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研究代表者 |
小川 裕子 帝京平成大学, 薬学部, 講師 (30267330)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | マクロファージ / エキソソーム / DPP IV / ERAP1 / 一酸化窒素 / 貪食 / 細胞間情報伝達 / 唾液 |
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| 研究概要 |
マウスマクロファージ細胞株（RAW264.7）に（ヒト唾液由来）DPPIV-エキソソームを終濃度50 ug/mLとなるよう添加すると、陽性対照の1 ug/mL LPSと同程度のiNOSの発現亢進が認められた。このDPPIV-エキソソーム依存的RAW264.7活性化はDPP IV阻害剤では抑制されず、LPS受容体阻害剤であるポリミキシンBによってほぼ完全に抑制された。よってDPPIV-エキソソームは体内で何らかの分子を介在してLPSを結合し、マクロファージを活性化させると考えられた。
次にDPPIV－エキソソームのLPS結合タンパク質を同定するため、同エキソソーム中におけるLPS受容体であるTLR4およびそのアダプター分子群の存在をウエスタンブロットで確かめた。現在までに少なくとも3種のLPS結合関連タンパク質（CD14、LBP、MD2）が他のエキソソームより豊富に含まれていることが判明した。
またLPSで活性化したRAW264.7よりERAP1エキソソームを単離し、未活性化状態のRAW264.7に添加すると、終濃度50 ug/mL添加時にはLPS阻害剤存在下においてもLPS刺激時と同程度の活性化（NO産生および貪食活性の亢進）を認めた。
DPPIV－エキソソームの生体内での挙動をin vivoレベルで調べる前段階として、物理化学的安定性を検討した。精製DPPIV－エキソソームのタンパク濃度、DPP IV活性、電子顕微鏡画像は4 ℃、2年経過後もほぼ保たれていた。全唾液を4 ℃保存し、唾液中のDPPIV－エキソソームの安定性を検討したところ、約10日までは変化しないと考えられた。37 ℃でも6時間までは変化せず、プロテアーゼには比較的安定と考えられた。胃内での安定性を検討するため、DPPIV-エキソソームを37 ℃、pH 3にしたところ胃内通過時間(～2 h）ではほぼ安定であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度の計画では機能性エキソソームの生理的役割の解明を予定していた。DPP IV－エキソソームがERAP1－エキソソームと同様にマウスマクロファージ細胞株（RAW264.7）からiNOSの発現を亢進させ、NO産生を起こしてRAW264.7を活性化することを見いだした。さらに、このRAW264.7の活性化はLPSなどのエキソソームが取り込んだ外来物質による自然免疫機構を介していると考えられた。唾液中のエキソソームはDPP IV-エキソソームとDPP IV非含有エキソソームの2種類に分離することがすでに可能であるが、DPP IV-エキソソームのみからRAW264.7のNO産生を認めた。よって、DPP IV－エキソソームにのみ存在する分子群がRAW264.7活性化に関与すると考えられた。エキソソーム上のLPSによる自然免疫の活性化経路はこれまでに報告がない。エキソソームが選択的に外来生物由来の物質を結合し、積極的にマクロファージ（Mφ）の活性化を行っていることを証明すれば、新しい生体防御機構の発見といえる。現在その機構を検討中であるが、少なくともLPS結合タンパク質群がDPP IV－エキソソームに多く含まれることを見いだしたので、解明の手がかりは得ている。よって、当初の予測とは若干異なるものの、Mφ活性化機構についての解明は進んでいると考える。
平成26年度以降に予定しているDPPIV－エキソソームの生体内での挙動の検討および機能性エキソソームの作成のための準備として、エキソソームの物理化学的安定性について検討した。エキソソームは予想以上に安定な膜構造を保つという結果は、エキソソームが生体内で循環して情報伝達している可能性を示す上に、機能性エキソソームの作成を円滑に進め、オーダーメイド医療に用いる際の基礎データとなりうる。よって、研究はおおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の予定通り、エキソソーム免疫カスケードの全容の解明および機能性エキソソームの開発とその臨床的応用のための分子基盤の構築を行う。DPP IV－エキソソームによるマウスマクロファージ細胞株（RAW264.7）の活性化作用は、DPP IV－エキソソーム上のLPSを介していることから、エキソソームが外来抗原を捕捉してマクロファージ（Mφ）に積極的に提示する、自然免疫賦活化作用が考えられた。さらにERAP1－エキソソームはRAW264.7活性化後に分泌されたことから、LPS非依存的かつ連鎖的なMφ活性化を起こすと予測される。よって計画通りの手法でエキソソーム免疫カスケードの証明を行う。なお、ヒト唾液由来DPP IV－エキソソームはLPSを豊富に含み、唾液中のエキソソーム濃度は細胞培養上清の約100倍であるので、初期段階での検討にはヒト唾液由来エキソソームも用いることとし、所属大学の倫理委員会の承認（研究課題「ヒト唾液由来エキソソームの機能解析に関する研究」、承認番号25-020）を受けた。承認内容を遵守し個人情報の取扱いに配慮して研究計画を遂行する。
DPP IV－エキソソーム上のDPP IVはRAW264.7のiNOSの発現亢進によるNO産生には関与しなかったが、DPP IV－エキソソーム又はrDPP IVのRAW264.7への添加はアポトーシス様の形態変化を起こした。よってサイトカインの産生および貪食作用を指標としてエキソソーム上のDPP IVのRAW264.7への作用をさらに検討する。
エキソソームは4℃保存で長期に安定であったので、安定性の検討をさらに詳細に行う。エキソソームは胃を通過する可能性があるので、体内での挙動をさらに検討するために、ペプシン等の消化酵素のエキソソームへの影響、動物実験による体内での挙動を調べ、機能性エキソソームの臨床的応用のための基礎データとしたい。
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