| 研究課題/領域番号 |
25460199
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
出口 芳春 帝京大学, 薬学部, 教授 (40254255)
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| 研究分担者 |
樋口 慧 帝京大学, 薬学部, 助教 (10625304)
黄倉 崇 帝京大学, 薬学部, 准教授 (80326123)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 血液脳関門 / ヒト脳移行性 / トランスポーター / 有機カチオン性薬物 / 血液脳関門モデル細胞 |
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| 研究概要 |
ヒト血液脳関門(BBB)モデルであるhCMEC/D3細胞を用い、薬物のBBB輸送機構を網羅的に解析するカクテルドーシング法の確立することが本研究課題の目的の一つである。本年度はhCMEC/D3細胞に発現しているプロトン/有機カチオン(H+/OC)交換輸送系に着目し、in vitroカクテルドーシング法の有用性と限界について検討した。
H+/OC交換輸送体に認識される薬物、およびその候補7種の混合液をカクテルとし、様々な条件下で取り込み実験を行った。薬物の定量はLC-MS/MSにて行った。まずカクテル溶液中の適正な薬物数と濃度について検討した結果、薬物の総濃度が10μM以内となる薬物数であれば、単剤とカクテルの取り込みに有意差はみられなかった。一方、薬物の総濃度が20μMを超えると、全ての薬物で濃度依存的に取り込みが減少した。H+/OC交換輸送体のKm値が50μM近傍であることから、この結果は輸送系のKm値に依存することがわかった。次にカクテルドーシング法で阻害実験が可能かを検討した。阻害剤として用いた0.1 mM以上のピリラミンおよびジフェンヒドラミンにより、カクテル中の全ての薬物の取り込みが有意に減少した。一方で、メマンチン取り込みは、1 mMトラマドールにおいて、また、キニジンは今回検討した条件において、他の薬物ほどの顕著な阻害効果は観察されなかった。このように、カクテルドーシング法においても阻害プロファイルから輸送の共通性や差異の検出が可能であることが示された。
以上、本年度の検討結果から、hCMEC/D3細胞を用いたカクテルドーシング法は、薬物濃度及び数を適切に設定することにより、H+/OC交換輸送の特性を検出することが可能であり、基質スクリーニング効率の向上に寄与しうることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題は、ヒト血液脳関門(BBB)モデルであるhCMEC/D3細胞を用い、薬物のBBB輸送機構を解明する汎用性の高い実験的評価法を確立することである。本年度は薬物のBBB輸送機構を網羅的に解析するカクテルドーシング法について検討した。その結果、カクテルに用いる薬物の数、濃度等の基本条件に対し適正化を図ることに成功した。また、今回検討した実験的評価法が薬物の輸送特性を判定できる方法であることも明らかになった。このような理由から、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度の研究成果に基づき、次年度はin vitro カクテルドーシング法を用いて、輸送の駆動力およびエネルギー依存性などが検討できるかを検討する。さらに、標的トランスポーターとしてカチオン性トランスポーターであるOCTN1およびOCTN2、PMATについて基質スクリーニングが可能かについて検討する。加えて、今年度の研究成果を活かし、ブレインマイクロダイアリシス法を用いたin vivoマイクロドーシングの有用性と限界について検討するとともに、in vitro細胞系とin vivoの整合性を評価する。In vitroとin vivoの方法論の包括的評価は、in vitroで得られたBBB薬物輸送機構の結果に確証を与える。
当初、26年度の研究実施計画に掲げたフロー培養システムの構築を具現化するため、ibid社制のフローシステムを当研究費にて購入し、タイトジャンクション形成能の変化等、基礎的なデータを収集する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
血液脳関門細胞hCMEC/D3細胞の培養に必要な培養液および血清はストックを流用した。そのため200,000円は今年度使用しなかった。
血液脳関門細胞hCMEC/D3細胞の培養に必要な培養液および血清の26年度分購入費として200,000円を使用する。
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