研究課題/領域番号 |
25460220
|
研究種目 |
基盤研究(C)
|
研究機関 | 東北薬科大学 |
研究代表者 |
菅野 秀一 東北薬科大学, 薬学部, 准教授 (00347907)
|
研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
キーワード | 酸化的ストレス / 薬剤性肝障害 / アセトアミノフェン / 活性酸素 / 抗酸化酵素 |
研究概要 |
本研究の目的は、薬剤性肝障害を生じやすい患者または使用者の感受性危険因子を予測することにより、薬剤性肝障害の発生を阻止すること、そして肝障害の新たな治療戦略を開発することに寄与する研究である。 本年度の研究実施計画として、(1)マウスをGenotypingすることにより遺伝子発現を確認し、(2)薬剤性肝障害を誘発させて、(3)肝障害の結果と候補遺伝子を照合することを計画した。具体的には下記のように研究を進行した。 酸化的ストレスを介した薬剤性肝障害の誘発物質として、解熱鎮痛薬として広く汎用されるアセトアミノフェンに焦点を置いた。実験は、マウスへ薬物を投与する前に採血をし、血液中からtotal RNAを抽出した。感受性因子を探索するGenotypingの手段としてリアルタイムPCRを用い、採取したRNAよりcDNAを合成し、PCRのtemplateとして使用した。酸化的ストレスを介した感受性因子の候補として、活性酸素酸性酵素や抗酸化酵素、あるいは過去に報告されているアセトアミノフェンによる肝毒性のメディエーターや免疫系調節物質などを標的としてPCRを行った。マウスへアセトアミノフェンを経口投与し、肝障害を誘発させた後、採血をして血清を回収した。血清中のトランスアミナーゼ活性(AST,ALT)を測定、ならびに投与マウスを開腹して肝臓への障害度を指標とし、肝障害の発生を確認した。 研究初年度であることから、実験系の確立と基礎データの採取を中心に実施した。本年度で得られた知見をもとに、更なる展開を広げて研究を行う予定である。
|
現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Genotypingを行う候補遺伝子は、文献検索による過去の学術論文より候補となり得る遺伝子群より、約40遺伝子を選出し、相補的なプライマーを外部発注にて合成し用いた。候補遺伝子群の発現を探索するために用いるリアルタイムPCRは、多検体を処理し、データを網羅的に解析する必要があるため、96wellプレートを使用して行うことができる、本学中央機器室に設置してあるStep-OneリアルタイムPCR(ライフテクノロジー社製)を使用した。PCRの条件は、メーカーより市販されているリアルタイムPCR専用の試薬(TOYOBO社製)を用い、マニュアルに準じて使用した。候補遺伝子群の中でも、PCR反応が認められないものや検出に乏しいものは候補より除外した。実験対象となるマウスは本学実験動物センターにて使用申請を行い、許可を得た後に飼育・使用した。マウスへ投与するアセトアミノフェンの投与量や採血のタイミングなどは、これまで当教室にて行われてきた研究実績を参考として行った。本年度の研究は、ddY系雄性マウスを使用し、1群10匹として10回分(100匹のマウス)よりデータを採取した。 現在、採取した検体より、候補遺伝子群の発現と肝障害を生じた結果を照合してデータの解析を進めている。
|
今後の研究の推進方策 |
昨年度に引き続き、当年度の前半はGenotypingと肝障害の結果を照合して実験結果をまとめ、これまでの成果について学会発表と論文報告を行う(中間報告)。候補遺伝子群が決定された後、それら遺伝子群を発現するベクターを構築して遺伝子導入を行う。感受性の規定因子として候補として挙げられた遺伝子群をIn vitro実験系において立証するため、ヒト肝臓癌細胞株へ恒常的に標的タンパク質を強発現させる変異細胞株を樹立する。これら標的タンパク質を発現する遺伝子の導入技術については、これまで当教室で行われてきた経験と実験手技を用いることにより、作製の円滑化を図る。
|
次年度の研究費の使用計画 |
In vitroの実験を着手するにあたり、その準備として器具・試薬購入をする予定であったが、当該年度では動物実験(In vivo)のデータ解析に至るまでの進行となったため、次年度使用額として計上する。 当該年度で得られたIn vivoにおける実験結果を元に、In vitroでの実験を行う必要があるため、実験で使用するディスポーザブル・プラスチック製品(培養フラスコ、ピペット、マルチウェルプレートなど)の購入や実験試薬(液体培地・血清・遺伝子導入試薬)の購入に要する。
|