| 研究課題/領域番号 |
25460241
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
若山 友彦 金沢大学, 医学系, 准教授 (70305100)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 精巣 / 精子形成 / 造精細胞 / 細胞接着分子 / アダプター蛋白質 |
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| 研究概要 |
Yeast-two-hybrid (Y2H)法により、細胞接着分子CADM1の細胞内領域相互作用するアダプター蛋白質BSPRYがに関して、その相互作用部位を検討した。まず、Y2H法により、BSPRYの２つの機能ドメイン、すなわち、B-boxドメインとSPRYドメインごとのそれぞれの変異体を作製して、CADM1の細胞内領域との相互作用をみると、SPRYドメインと相互作用することが分かった。さらに、CADM1のC末のPDZ結合モチーフと相互作用していることも明らかになった。この結果についてCADM1の細胞内領域のHis-tag融合蛋白質(CADM1-His)とBSPRYのSPRYドメインのGST融合蛋白質(BSPRY-GST)を用いたpull-down法により確認をした。
抗BSPRY抗体による免疫沈降産物を質量分析することにより、BSPRYと相互作用する分子を探索した。野生型マウスの精巣の蛋白質を可溶化して可溶性分画を得る。この可溶化分画とラット抗マウスBSPRY抗体を反応させて免疫沈降を行った。対照として正常ラットIgGを用いた。抗BSPRY抗体でのみ免疫沈降される蛋白質のバンドをSDS-PAGEと銀染色で見いだした。免疫沈降法をSDS-PAGEをして分離したバンドをペプチダーゼ消化とMALDI TOF/TOFによるMS/MS解析によりペプチドの配列を決定し、22個の分子を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
細胞接着分子CADM1とアダプター蛋白質BSPRYの相互作用部位を同定することができた。さらに、BSPRYと相互作用する可能性がある分子を複数個以上得ることができているので、研究はおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
アダプター蛋白質BSPRYと相互作用する分子の解析を進め、真に相互作用する分子の同定を目指す。また、BSPRYの遺伝子欠損マウスを作製して、精子形成における機能解析を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
アダプター蛋白質BSPRYの遺伝子欠損マウスをThe European Mouse Mutant Archive (EMMA)においてすでに作製されたマウスの凍結胚として導入したが、その費用の支払いが終わっていないためである。
The European Mouse Mutant Archive (EMMA)から導入したアダプター蛋白質BSPRYの遺伝子欠損マウスの凍結胚の費用と輸送費として次年度の支払いに利用する。
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