| 研究課題/領域番号 |
25460258
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
近藤 晶子 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 助教 (90396838)
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| 研究分担者 |
佐藤 洋一 東京大学, 生産技術研究所, 教授 (70302627)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 発生生物学 |
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| 研究概要 |
胚の発生初期では、頭尾軸と背腹軸に沿って時々刻々と変化が起きる。しかし、発生過程で分化誘導シグナルが活性化する時期についての詳細な研究は遅れている。
本研究提案では、選択的平面照明顕微鏡（DSLM）でゼブラフィッシュの全胚多色蛍光ライブイメージングを用い、特に背腹軸の分化誘導シグナルに着目し全胚での時間変化を調べることを目的としている。
ゼブラフィッシュ初期胚で、分化誘導シグナルが活性化される場所と時期の定量的な解析法の開発ために、まず可視化方法がすでに報告されているNodalシグナルに着目した。予備的な結果ではあるが、bimolecular fluorescence complementation法でsmad2/smad4の相互作用を可視化することで、Nodalシグナル応答を蛍光顕微鏡で観察した。今後、他の方法で検出した結果と比較することで、検証を行う予定である。
ゼブラフィッシュ胚では形態の似た細胞が隣接しているため、細胞の区別、さらにはトラッキングが難しい。核標識したゼブラフィッシュ胚を用い、細胞集団のトラッキング法の開発も試みた。また、細胞を区別するため、光刺激により細胞を局所的に蛍光標識した胚を、DSLMでライブイメージングすることができた。今後、局所的に細胞を標識した胚を用いての解析方法の評価も試みる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度の達成目標として、ゼブラフィッシュ初期胚で、分化誘導シグナルが活性化される場所と時期の定量的な解析法を開発のために、(1)Nodalシグナルの応答を可視化しDSLMでライブイメージングする、(2)核標識した胚で細胞集団のトラッキング法を開発する、ことを設定した。
Nodalシグナル応答を可視化に関しては、DSLMでの観察は行っていないものの、蛍光顕微鏡でbimolecular fluorescence complementation法でsmad2/smad4の相互作用を可視化することができたため、おおむね順調であると考えた。
核標識した胚で細胞集団のトラッキング法開発は、予定通り実施することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、分化誘導シグナルの可視化に重点を置き、研究を進める予定である。まず、bimolecular fluorescence complementation法で得られたNodalシグナル応答を検証する。具体的には、smad2の核局在等他の方法で検出したシグナルの局在と比較する。その後、DSLMでのライブイメージングを行う。
さらに得られたNodalシグナルのタイムラプス画像から、シグナル強度の時間変化、比較をするための数理解析的方法論を開発も試みる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
実験の進捗により試薬の使用状況が予想と異なったため、予定より使用額が少なくなった。
来年度はin situ hybridization法等によるゼブラフィッシュ胚の遺伝子発現解析を多く予定している。これらの実験に用いる試薬の購入に使用する予定である。
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