研究課題
基盤研究(C)
免疫応答の効率的な誘導には、免疫応答の「場」となる二次リンパ組織に免疫細胞を適切に動員することが重要である。ナイーブリンパ球は高内皮細静脈 (High endothelial venules: HEV) と呼ばれる特殊な血管から二次リンパ組織に入るが、これまでHEV形成の分子メカニズムは不明であった。私はHEV形成期におけるHEV内皮細胞分離技術の開発を行い、初めて胎生期HEV内皮細胞の遺伝子発現解析に成功し、選択的に発現する複数の転写因子を同定した。本年度は、HEV形成におけるこの転写因子の役割を明らかにするために、この遺伝子が血管内皮細胞で特異的に欠損するコンディショナルノックアウトマウス作成に着手した。現在このマウスの繁殖行い組織解析を進めている。また遺伝子を恒常的に発現するトランスジェニックマウスの作製を試みたところ、胎生期から恒常的に遺伝子発現させた場合には胎仔を得ることができなかった。そこで、そこで血管特異的に遺伝子が強制発現されるコンディショナルトランスジェニックマウスを作製した。現在founderマウスを得ることに成功し、繁殖を行っている。さらに私はこの遺伝子の発現を負に調節する可能性のある上流転写因子候補を同定した。この上流転写因子の発現パターンを二次リンパ組織で解析したところ、新生仔マウスのリンパ節ストローマで発現が高いことが明らかになった。この上流転写因子の遺伝子欠損マウスではリンパ節ストローマ領域でのHEV形成が亢進していることを考え合わせると、この転写因子が新生仔期の二次リンパ節ストローマにおけるHEV形成を調節する可能性が考えられた。
2: おおむね順調に進展している
HEV形成調節に関与する可能性のある転写因子候補のnull欠損マウスは生後一日以内に志望する。このため、血管内皮細胞で特異的に遺伝子欠損するコンディショナルノックアウト作成を試みた。一年目で計画していたベクター作成、ES細胞への遺伝子導入、生殖系列キメラの獲得まで予定通りに進行した。またこの転写因子を過剰発現するトランスジェニックマウスの作成を試みたところ、当初予定していた恒常的発現プロモーターを用いてのマウス作出は成功しなかった。そこで、血管内皮細胞特異的強制発現ベクターを用いて遺伝子発現を試みた。このマウスの作出についてもベクター作成、ES細胞への遺伝子導入、生殖系列キメラの獲得まで予定通り進行している。
HEV形成調節候補転写因子を血管内皮細胞特異的に遺伝子欠損させるため、血管内皮細胞選択的プロモーターによりCreが発現するTie2 promoter-Cre deleterマウスと交配する。この方法で血管特異的コンディショナルマウスリンパ節におけるHEV形成を解析する。解析は形態的解析および免疫組織学的解析を行う。血管特異的トランスジェニックマウスは、stop sequence-floxedマウスを得た後Tie2 promoter-Cre deleterマウスと交配することで強制発現誘導する。この組換えマウスリンパ節におけるHEV形成と機能に亢進がみられる可能性を追究する。さらにこの転写因子の発現を負に調節する可能性のある上流転写因子候補を同定したので、プロモーターに結合する可能性をCHIPアッセイにより解析する。またこの遺伝子の転写が負に調節される可能性について、レポーターアッセイにより解析する。
本年度は遺伝子組換えマウスの作成のために、ベクターの構築、細胞培養、遺伝子導入のために基金を使用した。当初の計画では組換え動物のコロニー拡大、繁殖のための動物飼育代金を計上していたが、本年度はfounderマウスを得るところまで計画が進行したので、次年度に飼育代の大半を繰り越しした。遺伝子組換えマウスの繁殖を行い、genotypingを行う。ヘテロマウス同士の掛け合わせ、血管内皮細胞とくいてきプロモーターをもつCre deleterマウスと掛け合わせることにより、血管特異的ノックアウトマウス、トランスジェニックマウスを作出する。前年度からの繰越は主に動物飼育代に使用する。
すべて 2013 その他
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (2件) (うち招待講演 1件)
PLoS One
巻: 8 ページ: e83681
10.1371/journal.pone.0083681
生体の科学
巻: 64 ページ: 398-399
