| 研究課題/領域番号 |
25460278
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 兵庫医科大学 |
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研究代表者 |
前田 誠司 兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (10309445)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 腎臓 / 自律神経系 / ネフロン / 大内臓神経 / 交感神経幹 |
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| 研究概要 |
ラット腎臓支配神経の標識とその分布を解析した。腎神経の特異的標識を行うために、マイクロカプセルを用いて腎神経叢のみに神経トレーサーを導入する方法を開発した。従来の標識法では、腎支配神経細胞が分布する神経節は、交感神経系では椎前神経節群や交感神経幹など諸説がみられたが、本法を用いることによりトレーサーの漏洩を防ぎ、かつ長時間の暴露が可能になった。その結果、腎神経の主要な神経節は、椎前神経節群では大内臓神経上に位置する腎上神経節(SrG)に、交感神経幹ではT12およびT13であることが示された。よって従来考えられてきた腹腔神経節や腎動脈神経節は副次的な神経節であることが示唆された。また、副交感神経系の投射については、迷走神経投射説や骨盤神経などが考えられたが、本法による解析の結果、これらの神経中枢に標識細胞は観察されなかった。よって腎神経叢にはこれら副交感神経系は含まれていないことが示唆された。
腎臓内に投射する神経細胞の神経節分布と腎区域に序列性があるかを調べた。ラット腎上区および腎下区にそれぞれ逆行性神経トレーサーを圧注入し、SrGおよび交感神経幹における標識細胞の計測を行った。その結果、腎上区注入群では腎上神経節に最も多く標識細胞がみられ、腎下区注入群では交感神経幹T13に最も多くみられた。T12では有意差は認められなかった。また、異なる色相の神経トレーサーを腎上区および腎下区にそれぞれ注入したところ、二重標識された細胞は観察されなかった。このことから、腎上部および腎下部に投射する神経細胞には区域対応傾向があることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の達成目標としては、腎神経叢を構成するニューロンの神経節を同定し、そのトポグラフを作成することにあった。腎臓を支配する交感神経の主要な神経節が腎上神経節および交感神経幹T12～T13にあることを明らかにし、さらに副交感神経系はこれらに加わらないことを示したことで、腎神経叢の遠心路の構成がほぼ解明された。また、腎投射遠心性神経に区域対応が存在することが明らかとなったことで、腎支配神経の機能解析実験の為のターゲットを絞り込むことができた。しかしながら、本年度予定していたTwo-photon顕微鏡によるこれらの細胞の神経節内立体構築は、当該機器の不調・調整の原因により、数回の試験しか行えず、データとしてまとめることができなかった。その代替として、従来の連続切片法により構築の解析を進めている。
非神経性アセチルコリンの発現については、その発現量の低さにより、安定したデータは得られなかった。一方で、アセチルコリンの作用経路を解明する為、各種受容体発現の解析をラット・マウスの腎組織および株化モデル細胞を用いて行った。その結果、ムスカリン性アセチルコリン受容体M1およびアドレナリン受容体β2が腎集合管に発現しており、さらに体液の酸塩基平衡に働くintercalated細胞にも発現していることを示した。これらのことから、腎神経や腎内在性非神経細胞によって分泌される神経伝達物質は、血管平滑筋のみならず、ネフロンに直接作用して酸塩基平衡をコントロールしている可能性を示すデータが得られつつある。
以上から、実験は概ね予定どおり進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
腎支配神経の主要な神経節とその分布序列が明らかになったことから、これらを順行性に標識し、各神経節ニューロンの腎組織への投射終末の分布を解明する。腹腔側よりアプローチしやすい腎上神経節－腎上区ニューロンをターゲットとし、順行性トレーサーを用いて、神経終末の形状および対応する標的細胞までを可視化する。
非神経性アセチルコリンの発現については、増感法を改善したin situハイブリダイゼーション、RT-PCR法およびリアルタイムPCR法にて、アセチルコリン合成酵素であるChATのスプライシングパターンの発現および分布を解明していく。
腎臓に作用するアセチルコリンの発現量が病理的状態で上昇する可能性が示唆されていることから、腎臓アセチルコリン上昇を人為的に引き起こし、その動態を観察することを計画している。次年度はそのモデル動物の作成を行う。手法としては麻酔下のラットの腎血管を閉塞させ、虚血/再灌流傷害モデルを用いる。但し、手術の際に腎神経を損傷することで、腎内環境が変化する可能性が十分考えられるため、当初の計画であった単純結紮法ではなく、腎カテーテル法の開発を試みる。すなわち、腹大動脈から腎動脈へ向けて先端をアクリル処理したカテーテルを挿入して腎動脈を閉塞させ、腎虚血・再灌流を行う。処理した腎臓は各区域に分割し、RNAおよびタンパク質を精製する。また、同処置によるSrGおよび交感神経幹神経の変異を調べるために、これらの組織上での神経伝達物質合成酵素の発現変化を観察する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
一部の動物実験が次年度に引き継がれたため、当該年度の使用動物数が少なくなった。
実験計画上では、引き続き動物実験の前実験を行う予定である。前年度から繰り越した助成金は、本来、前年度に充てられる予定であった動物の購入費として使用する。
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