| 研究課題/領域番号 |
25460295
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
小林 武志 札幌医科大学, 医学部, 講師 (80363688)
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| 研究分担者 |
當瀬 規嗣 札幌医科大学, 医学部, 教授 (80192657)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | rat / heart primordium / E-C coupling / calcium transient |
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| 研究概要 |
本年はまず、マイクロアレー法を行った。心拍動開始前後の時期のratの心臓（心臓原基）は非常に小さく、サンプル採集に難渋したが完遂することができた。その結果、Wistar ratの心臓原基の全遺伝子のRNAの心拍動開始前後における変化を取得することが出来た。当初観察を希求していたミオシン、アクチン、トロポニンT、トロポニンC、トロポニンIはすべてこの時期に増加していることを確認した。
マイクロアレー法はmRNAの変化を観察する実験方法であるので、次に実際のタンパク質の変化をウエスタンブロット法にて確認することにした。当初の計画では、胎児から摘出した心臓原基は速やかにTCA/acetone/DTT液に浸透させ、次いでacetone/DTT液を用いてTCAを洗い流す計画を立案していた。そのため、その計画に従い実際に実施したところ、獲得試料の喪失が生じた。これは小さく、しかも柔らかい心臓原基を何度も洗浄しなければいけないことに由来していることが判明した。そこで、摘出した心臓原基を直接サンプルバッファーに溶解し、95℃に加熱する方法に変更を行った。こうして得た試料を用い、心拍動開始前後でのウエスタンブロット法を行うことが出来た。本年はこの方法を用い、トロポニンIのこの時期での増加を観察した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前述のように心拍動開始前後の時期のratの心臓（心臓原基）は非常に小さく、マイクロアレー法を行うために必要なサンプルの採集に難渋した。また、同様にTCA/acetone/DTT処理で獲得試料が喪失したため、直接サンプルバッファーで処理をするという代替法を確立するのに時間が必要であった。このような理由より、実験の遂行に遅れが生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はまず、当初の実験計画で平成25年度に行う予定としていた心拍動開始前後の時期でのミオシン、アクチン、トロポニンT、トロポニンC、トロポニンIのリン酸化率の変化の測定を行う予定である。
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