神経・免疫系による腸管恒常性維持制御機構とその破綻

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25460380
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 幡野 雅彦 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20208523)
• 研究分担者: 藤村 理紗 千葉大学, バイオメディカル研究センター, 助教 (30376363)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 炎症性腸疾患 / 腸管神経 / 腸内フローラ / 腸管上皮バリア / 遺伝子組換えマウス / nNOS

研究概要

腸管神経細胞が増加している遺伝子改変マウス(Ncx KOマウス、Kif26a KOマウス)を用いて腸管上皮細胞の構築、腸内フローラ、腸管免疫についての解析を行った。
(１) Ncx KOマウス腸管神経節においては一酸化窒素(NO)産生ニューロンが増加している。Ncx KOマウスにおいては腸管神経細胞由来のNOが上皮細胞に作用し、β-cateninのSNO化、E-cadherinのジャンクションからの解離をきたし上皮細胞バリア機能が破綻するとの仮説をたてた。この仮説の検証のために以下の実験を行った。（a）Ncx KOマウスの腸管上皮細胞におけるS-nitrosylationについてウエスタンブロットにて解析したところS-nitrosylationされた蛋白が増加していた。（b）nNOS特異的な阻害剤L-NPAをNcx KOマウスに投与しE-cadherinの発現および腸管透過性について解析したところ、L-NPA投与によりE-cadherinの発現は増加した。（c）抗ニトロチロシン抗体によりNcx KOマウスの腸管を免疫染色しNO産生について解析したところ、一部の上皮細胞において濃く染色される細胞が見いだされた。
（３）同じケージ内で飼育しているNcx KOおよび野生型マウスの糞便より経時的にDNAを抽出する。各細菌特異的な16SrRNAのプライマーを用いquantitative real-time PCRを行い腸内細菌フローラについて質的・量的な解析を行ったところKOマウスにおいてはEnterobacteriaceaeの増加、およびBifidobacteriumの減少傾向が認められた。
（４）Ncx KOマウスの腸管免疫系について解析を行い神経由来NOの腸管免疫系制御響について解析をおこなった。Ncx KOマウスおよびKif26a KOマウスともに糞便中のIgAの減少傾向が認められた。
以上の結果よりNcx KOマウス、Kif26a KOマウスともに腸内フローラにおいてdysbiosisが起きていることが示唆され、腸管神経細胞増加にともなうNOによるものであることが推測された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

腸管上皮細胞のバリア機構の低下が腸管神経増加にともなうNOによるものであることが明らかとなった。また、腸管神経細胞増加によりdysbiosisをおこすことも明らかとなった。これらの成果は第42回日本免疫学会において講演発表を行った。

今後の研究の推進方策

Ncx KOマウスにおける上皮細胞バリアと神経細胞増加の関連がほぼ明らかとなったが、腸内フローラとの関連についてもより詳細に詰めていく予定である。次世代シークエンサーを用いた腸内細菌層の解析も視野にいれ進めていく予定である。また、免疫系の異常についても今後重点を置いて解析する。
同様の表現系を持つKif26a KOマウス、Nczfヘテロマウスについても解析を進め、腸管神経系と腸管免疫、腸管バリア機構の相互関係について分子レベルで明らかにする。

次年度の研究費の使用計画

消耗品の一部が他の経費により購入できたため。
試薬等消耗品の購入に使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Plant homeodomain finger protein 11 promotes class switch recombination to IgE in murine activated B cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ikari, J., Inamine, A., Yamamoto, T., Watanabe-Takano, H., Yoshida, N., Fujimura, L., Taniguchi, T., Sakamoto, A., Hatano, M., Tatsumi, K., Tokuhisa, T.and Arima, M.
  • 雑誌名: Allergy 巻: 69 ページ: 223-230
  • DOI: 10.1111/all.12328
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation of tissue-specific H-2Kd transgenic mice for the study of K(d)-restricted malaria epitope-specific CD8+ T-cell responses in vivo. (2013)
  • 著者名/発表者名: Huang, J., Li, X., Kohno, K., Hatano, M., Tokuhisa, T., Murray, P.J., Brocker, T. and Tsuji, M.
  • 雑誌名: J.Immunol.Methods 巻: 387 ページ: 254-261.
  • DOI: 10.1016/j.jim.2012.10.019
  • 査読あり
• [雑誌論文] ADAR1 protein induces adenosine-targeted DNA mutations in senescent Bcl6 gene-deficient cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Tsuruoka, N., Arima, M., Yoshida, N., Okada, S., Sakamoto, A., Hatano, M., Satake, H., Arguni, E., Wang, J.Y., Yang, J.H., Nishikura, K., Sekiya, S., Shozu, M. and Tokuhisa, T.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem 巻: 288 ページ: 826-836
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.365718
  • 査読あり
• [雑誌論文] Integration of the mouse sperm fertilization-related protein equatorin into the acrosome during spermatogenesis as revealed by super-resolution and immunoelectron microscopy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ito, C., Yamatoya, K., Yoshida, K., Fujimura, L., Hatano, M., Miyado, K. and Toshimori, K.
  • 雑誌名: Cell Tissue Res. 巻: 352 ページ: 739-750
  • DOI: 10.1007/s00441013-1650-y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Lack of both α2-antiplasmin and plasminogen activator inhibitor type-1 induces high IgE production. (2013)
  • 著者名/発表者名: Okada, K., Ueshima, S., Kawao, N., Yano, M., Tamura, Y., Tanaka, M., Sakamoto, A., Hatano, M., Arima, M., Miyata, S., Nagai, N., Tokuhisa, T. and Matsuo, O.
  • 雑誌名: Life Sci. 巻: 93 ページ: 89-95
  • DOI: 10.1016/j.lfs.2013.05.023
  • 査読あり
• [雑誌論文] The effect of platelet-rich plasma on posterolateral lumbar fusion in a rat model. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kamoda, H., Ohtori, S., Ishikawa, T., Miyagi, M., Arai, G., Suzuki, M., Sakuma, Y., Oikawa, Y., Kubota, G., Orita, S., Eguchi, Y., Yamashita, M., Yamauchi, K., Inoue, G., Hatano, M. and Takahashi, K.
  • 雑誌名: J.Bone Joint Surg.Am. 巻: 95 ページ: 1109-1116
  • DOI: 10.2106/JBJS.L.00320
  • 査読あり
• [雑誌論文] Kinetics and protective role of autophagy in a mouse cecal ligation and puncture-induced sepsis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takahashi, W., Watanabe, E., Fujimura, L., Watanabe-Takano, H., Yoshidome, H., Swanson, P.E., Tokuhisa, T., Oda, S. and Hatano, M.
  • 雑誌名: Crit. Care 巻: 17 ページ: R160
  • 査読あり
• [学会発表] Bcl6 regulates production of SLAM-Associated protein in follicular helper T cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Toshibumi Taniguchi, Akemi Sakamoto, Masahiko Hatano, Kenji Matsumoto, Hirohisa Saito, Takeshi Tokuhisa and Masafumi Arima
  • 学会等名: 第42回日本免疫学会
  • 発表場所: 千葉・幕張メッセ
  • 年月日: 20131211-20131213
• [学会発表] Possible role of enteric neurons in regulation of intestinal microbiota. (2013)
  • 著者名/発表者名: Lisa Fujimura, Yukiko Ohara, Masafumi Arima, Akemi Sakamoto, Takeshi Tokuhisa and Masahiko Hatano
  • 学会等名: 第42回日本免疫学会
  • 発表場所: 千葉・幕張メッセ
  • 年月日: 20131211-20131213
• [学会発表] 高解像顕微鏡およびSTEDを用いた受精関連タンパク質Equatorinの解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 伊藤千鶴、大和屋健二、吉田恵一、藤村理紗、幡野雅彦、宮戸健二、年森清隆
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会第69回学術講演会
  • 発表場所: 大阪・ホテル阪急エキスポパーク
  • 年月日: 20130520-20130522
• [学会発表] 精子先体赤道部糖タンパク質equqtorinの分子量低下に関わる酵素の探索
  • 著者名/発表者名: 大和屋健二、伊藤千鶴、陳城、前川眞見子，幡野雅彦、年森清隆
  • 学会等名: 第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • 発表場所: 栃木・自治医科大学キャンパス