ゲノム編集を施したヒト気道上皮細胞株を基盤とするKRASシグナル経路の解析

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25460395
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: シバスンダラン カルナン 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30557096)
• 研究分担者: 小西 裕之 愛知医科大学, 医学部, 教授 (20344335) ; 細川 好孝 愛知医科大学, 医学部, 教授 (60229193)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: KRAS / 変異ノックイン / 気管支上皮細胞株

研究実績の概要

以前、研究代表者らは、アデノ随伴ウイルスの骨格を持つターゲッティングベクターを用いて非癌ヒト気管支上皮細胞に由来する不死化細胞株NuLi-1の遺伝子改変を行った。その結果、2本の野生型KRAS遺伝子アレルのうち1本が癌原性の活性化型KRASG12V変異アレルに置換（変異ノックイン）された細胞クローンを樹立した。
本研究ではまず、樹立したKRAS変異ノックインクローンの細胞特性を様々なアッセイによって野生型KRAS遺伝子を持つ対照クローンと比較した。その結果、KRAS変異ノックインクローンの細胞形態は疎な紡錘体様に変化しており、軟寒天培地中でも増殖し足場非依存性コロニーを形成することがわかった。また、ERKタンパク質の恒常的な過剰リン酸化を呈することから、KRASからの増殖シグナルを伝達する下流経路のうちMEK-ERK経路の活性が亢進していることが示唆された。これらの結果から、KRAS遺伝子1アレルへの活性化変異のノックインによってNuLi-1細胞株が一定の癌形質を獲得することが示された。
次に、KRAS変異ノックインクローンと対照クローンのマイクロアレイ解析を行ったところ、KRAS変異の有無によって遺伝子発現プロファイルが明確に2大別された。KRAS変異ノックインクローンでは上皮間葉転換の指標となる遺伝子の発現が亢進し、上皮マーカー遺伝子の発現が低下していた。また、プロテオーム解析を行ったところ、KRAS変異ノックインクローンにおいてコラーゲンおよびコラーゲン合成を制御する酵素タンパク質の発現が亢進していた。KRAS変異によって発現量が増加するこれらの分子の役割を調べるため、CRISPR-Cas9システムに基づく遺伝子ノックアウトを行った。今後、単離したクローンの表現型を解析することによって変異KRASの増殖シグナルを媒介する重要な分子を同定し、創薬標的を探索する方針である。

研究成果

• [雑誌論文] Delta40p53 suppresses tumor cell proliferation and induces cellular senescence in hepatocellular carcinoma cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Ota A, Nakao H, Sawada Y, Karnan S, Wahiduzzaman M, Inoue T, Kobayashi Y, Yamamoto T, Ishii N, Ohashi T, Nakade Y, Sato K, Itoh K, Konishi H, Hosokawa Y, Yoneda M
  • 雑誌名: J Cell Sci 巻: 130 ページ: 614-625
  • DOI: 10.1242/jcs.190736
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inhibition of Nox1 induces apoptosis by attenuating the AKT signaling pathway in oral squamous cell carcinoma cell lines (2016)
  • 著者名/発表者名: Ito K, Ota A, Ono T, Nakaoka T, Wahiduzzaman M, Karnan S, Konishi H, Furuhashi A, Hayashi T, Yamada Y, Hosokawa Y, and Kazaoka Y
  • 雑誌名: Oncol Rep 巻: 36 ページ: 2991-2998
  • DOI: 10.3892/or.2016.5068
  • 査読あり
• [雑誌論文] Efficient AAV-mediated gene targeting using 2A-based promoter-trap system (2016)
  • 著者名/発表者名: Karnan S, Ota A, Konishi Y, Wahiduzzaman M, Tsuzuki S, Hosokawa Y, and Konishi H
  • 雑誌名: Bio-Protoc 巻: 6 ページ: e2058
  • DOI: 10.21769/BioProtoc.2058
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] 遺伝子改変・ゲノム編集効率を測定するアッセイ系としてのPIGA遺伝子の利用 (2016)
  • 著者名/発表者名: 小西裕之, Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 都築忍, 細川好孝
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川・横浜）
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] NOX1はAKTシグナルを介して口腔扁平上非癌細胞の生存に寄与する (2016)
  • 著者名/発表者名: 太田明伸, Sivasundaram Karnan, 小西裕之, 風岡宜暁, 細川好孝
  • 学会等名: 第75回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川・横浜）
  • 年月日: 2016-10-06 – 2016-10-08
• [学会発表] 悪性胸膜中皮腫の早期診断の腫瘍マーカーの検討 (2016)
  • 著者名/発表者名: Sivasundaram Karnan, 太田明伸, Md Wahiduzzaman, 小西裕之, 細川好孝
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台国際センター（宮城・仙台）
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] Combined arsenic trioxide-cisplatin treatment enhances apoptosis in leukemic cell lines (2016)
  • 著者名/発表者名: Md Wahiduzzaman, Akinobu Ota, Sivasundaram Karnan, Hiroyuki Konishi, Yoshitaka Hosokawa
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台国際センター（宮城・仙台）
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] 肝がん細胞株におけるp53アイソフォームdelta40p53の性状解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 太田明伸, Md Wahiduzzaman, Sivasundaram Karnan, 小西裕之, 細川好孝
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台国際センター（宮城・仙台）
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] CRISPR-Cas9システムによる変異ノックイン ― プロモータートラップ法の比較検討 (2016)
  • 著者名/発表者名: 小西裕之, Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 都築忍, 細川好孝
  • 学会等名: 日本ゲノム編集学会第1回大会
  • 発表場所: 広島国際会議場（広島・広島）
  • 年月日: 2016-09-06 – 2016-09-07