| 研究課題/領域番号 |
25460433
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
明石 巧 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 准教授 (60242202)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 浸潤突起 / フォスファチジルイノシトール / 肺癌 / 基底膜 |
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| 研究概要 |
癌細胞の間質面に形成される浸潤突起は、細胞外基質の分解を介して癌細胞の浸潤に関与する。正常気道上皮では内腔側に局在する浸潤突起分子actinin1やcortactinが肺腺癌細胞では間質面に局在する異常が認められる。そこで浸潤突起分子の細胞内局在を制御する可能性が考えられているフォスファチジルイノシトール(PIPs)と浸潤突起分子の培養癌細胞内での局在を検索した。PIPsを可視化するためPI(345)P3、PI(34)P2、PI(45)P2と特異的に結合するGRP1、Tapp1、PLCD1のPHドメインとGFPとの融合分子、actinin1, cortactinとRFPとの融合分子を作製した。プラスミドを用いた遺伝子導入では細胞の長期生存が困難であったため、レンチウイルスベクターを作製し遺伝子の導入を行った。肺腺癌細胞A549では極性形成が不十分であったことから、大腸癌細胞Caco2を用い、マトリゲル内で3次元培養を行った。Caco2細胞は内腔面と基底膜を伴う腺管を形成し、PI(4,5)P2結合性のPLCD1とactinin1が内腔面側に一致した局在を認め、PI(4,5)P2が一部の浸潤突起分子の細胞内局在を制御している可能性が示唆された。一方、作製したGRP1、Tapp1プローブは細胞質に広く認められ想定した細胞内局在を示さずPI(345)P3、PI(34)P2の可視化には至らなかった。
浸潤突起構成分子の一つである中間径フィラメントであるサイトケラチンsubtypeの口腔エナメル上皮腫における発現profileを検索した。その結果、間質壊変を伴うエナメル上皮腫ではサイトケラチンの発現profileが異なっており、サイトケラチンsubtypeの発現変化が間質壊変に関与している可能性が考えられた。
PIPsをシグナル伝達に使うchemokineの発現を間質性肺炎で検索し、CCL17が間質性肺炎の急性増悪に関与することを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
フォスファチジルイノシトール結合性プローブの作製、レンチウイルスベクターを用いた癌細胞への遺伝子導入と長期の発現、共焦点顕微鏡を用いた蛍光発現の確認という研究の根幹部分は達成できた。またin vitroで極性構造を示す癌細胞中でPI(45)P2結合プローブの細胞内局在の確認をすることができた。一方、GRP1、Tapp1プローブは細胞質に広く認められ想定した細胞内局在を示さず、細胞毒性を持つ可能性があり、PI(345)P3、PI(34)P2の可視化には至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
GRP1、Tapp1プローブに変えてPI(345)P3、PI(34)P2に結合するAKT-PHドメインを用いたプローブの作製、ドキシサイクリン誘導系を用いた蛍光分子の短期間発現系の確立を行っている。
PHドメイン蛍光プローブに加えてFRETプローブを作製中であり、PIPsに加えて低分子量G蛋白活性の可視化を試みている。
肺癌組織におけるゲノムの網羅的解析データベース、遺伝子発現データベース、pathway databaseをもとに、ホスファチジルイノシトール代謝、RhoファミリーG蛋白の活性に関与する遺伝子の発現異常、変異をスクリーニングする。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
事務手続き上、次年度の使用額になった事が理由として挙げられる
次年度の消耗品として計上する
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