肝細胞癌で発現するp63の機能：DNA損傷応答およびウイルス発癌との関連

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25460475
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 山梨大学
• 研究代表者: 加藤 伊陽子 山梨大学, 医学工学総合研究部, 准教授 (20333297)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: TP63 / carinogenesis / transcription / TP53

研究概要

TP63（p63）はがん抑制遺伝子TP53(p53)ファミリー遺伝子で、主として未分化な外胚葉性上皮に発現し、細胞の増殖と分化に重要な役割を果たす。扁平上皮癌で高レベル発現するp63の機能に関する研究は多いが、肝細胞や肝癌細胞における発現様式と細胞分化および腫瘍化との関連については理解が進んでいない。
実施した項目：　1. 肝癌細胞株におけるp63の発現解析を行った。p63のTA型とΔN型の転写産物およびスプライス・アイソフォームについてRT-PCR法とWestern Blot法により解析した。がん抑制遺伝子TP53野生型 (p53wt)のHepG2株、TP53変異型（p53mut）のHuh7株、HLE株などの肝癌細を用いた。対称としてp53-nullのSAOS2骨肉種細胞株を用いた。２．p53およびp63のトランス・アクチベーション活性を検討した。TAp63およびp53の標的遺伝子のプロモーター領域を使ってレポータ・アッセイを実施した。
得られた結果：　1. Huh-7、HLE、FCL-4の肝癌由来細胞ではp63のTA型（α、β、γ）が主に発現しており、ΔN型はFCL-4以外では検出されなかった。p53wtを有するHepG2細胞ではp63の発現は全く検出されなかった。扁平上皮癌ではΔN-p63の発現が優勢であるが、p53に類似する構造を持つp63のTA型だけが発現している肝癌細胞が複数検出できた。２．Huh-7細胞でp21waf1などのプロモーターを用いて調べた結果、p53とTA型p63の転写誘導機能が抑制されることはなく、p53mutの肝癌細胞で発現しているTA型p63は正常に機能していると考えられた。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

H25年度の実施項目として、1.　DNA損傷応答性の解析 [DNA損傷の誘導]、 2.　遺伝子発現プロファイリング解析、3.　TAp63タンパク質活性化と細胞制御の検出を予定していた。研究代表者が使用する研究室の建物の改修工事が行われ、この間、実験室が使用不能で予定していた実験を実施できなかった。
この間に共同研究らとともに可能な基礎実験を行った。また次年度からのこの研究課題の予備実験として高感度のクロマチン免疫沈澱の実験条件を検討するなど、研究を推進する方策をとった。

今後の研究の推進方策

TP63の機能と肝細胞の腫瘍化の関連を明らかにする研究として、当初の計画よりもっと直接的なアプローチとして、次のような項目を優先して実施する。
1.　TP63の細胞遺伝子発現調節：(1)TP63のTA型（TAp63）を産生している癌細胞において、TAp63が全ゲノム配列のどのような遺伝子のプロモーターに直接結合しているのかを明らかにする。このために、高感度ChIP（クロマチン免疫沈澱）実験を行い、共沈したDNAについてシークエンスを実施する。(2)　肝癌細胞におけるTP63ノックダウンを行い、p63の有無による遺伝子発現の変化を検出する。qRT-PCR法、遺伝子チップによる発現プロファイル解析を実施する。(3)それらの結果から、直接的に作用している遺伝子プロモーターであることを確認するために当該領域をクローニングしてレポータ・アッセイを行う。
2.　TP63とウイルス性発がん因子の直接および機能的なタンパク質相互作用の検討： B型肝炎ウイルス発がん因子HbxとTAp63の機能が互いに影響を及ぼすかどうか解析する。　(1)　プラスミドのトランスフェクションによりHBxを細胞に導入・発現させ、細胞にDNA損傷を施す。DNA損傷応答をタンパク質レベル（TAp63、p53の蓄積・活性化）、細胞レベル（細胞周期、細胞死、等）で検出し、HBxの影響を解析する。(2)　HBx導入によるTAp63標的遺伝子発現の変化を検出する。qRT-PCRまたは全ゲノム発現解析を実施する。(3)in vitro 転写・翻訳系（Promega社TnT法）において、TP63と HBx, DDB1（DNA損傷結合タンパク質）などとの相互作用を検討する。

次年度の研究費の使用計画

研究代表者が使用する実験室・研究室の建物の改修工事が行われたため、6か月以上の期間、居室のみ仮移転し、実験室は封鎖されて実験が実施できなかった。その間予定していた物品の購入を行わなかった。
当該年度(H25年度)から繰り越される額と、次年度(H26年度)に予定されている助成金を総合して、H26年度に使用する。繰り越し額（約750,000円）とH26年度直接経費予定額（1,300,000円）を合計すると H26年度予定の使用額が約 2,050,000円となる。主に機器および物品の購入経費とする。(1)Thermo社　パーソナル・リアルタイムPCRシステム（PikoReal) 1台、　山梨大学に設置（1,500,000円）、および(2)物品：特異抗体、培養器具、培地、ほか消耗品（ 550,000円）の費用とする計画である。

研究成果

• [雑誌論文] Impacts of endogenous retroviruses on tumorigenesis, immunity, stem cells, and research safety (2014)
  • 著者名/発表者名: Katoh I
  • 雑誌名: Frontiers in Oncology 巻: 4 ページ: 1-2
  • DOI: 10.3389/fonc.2014.00066
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of Endogenous Retroviruses and Long Terminal Repeats with Human Disorders. (2013)
  • 著者名/発表者名: Katoh I, Kurata S.
  • 雑誌名: Frontiers in Oncology 巻: 3 ページ: 1-8
  • DOI: 10.3389/fonc.2013.00234
  • 査読あり
• [学会発表] ｐ６３による新規Wnt/beta-cateninシグナル活性化機構 (2013)
  • 著者名/発表者名: 加藤伊陽子, 福西菜穂子, 藤室雅弘, 畑隆一郎, 倉田俊一
  • 学会等名: 第72回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 (横浜市）
  • 年月日: 20131003-20131003
• [学会発表] Detection of the import of procaspase-9 into the mitochondrial intermembrane space (2013)
  • 著者名/発表者名: Katoh I, Kurata S
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 (横浜市）
  • 年月日: 20130912-20130912
• [備考] 最近の研究内容
  • URL: http://sangaku.yamanashi.ac.jp/SearchResearcher/contents/7A93F75CD72F80F2.html