血管内投与型AAVベクターによるてんかんの遺伝子治療

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25460501
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 小黒 恵司 自治医科大学, 医学部, 准教授 (90231232)
• 研究分担者: 島崎 久仁子 自治医科大学, 医学部, 非常勤講師 (40142153) ; 横田 英典 自治医科大学, 医学部, 講師 (90254929)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: てんかん / 遺伝子治療 / ELマウス / AAVベクター

研究実績の概要

昨年度、安静時・発作時の脳血流量をTc-99mHMPPAO核種によるSPECT及びARG(autoradiography)により測定し、てんかん自然発生ELマウス（以下EL）の発作焦点が海馬のみでなく海馬と皮質にもあることを予測した。このことは、従来、てんかん抑制物質を定位脳手術によって海馬に投与する従来型の投与法では効果が不十分である可能性を示唆する。
さらに、昨年度、興奮抑制系である中間神経のEL海馬における発現をparvalbuminによる免疫組織化学的に検討したところ、対照DDYマウスに比し、有意に発現が少なく、ELにおける神経興奮の抑制系の脆弱性が示唆された。
これらの結果に基づき、本年は抑制系シナプス関連分子の遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを作成し、定位的海馬注入および血管内注入により同ベクターをELに投与し、てんかん抑制効果を観察した。緑色蛍光発色蛋白EGFP発現AAVベクター投与群をコントロールとした。てんかん抑制効果の評価は、発作の発現頻度、強さ、持続時間、強さX持続時間の各項目において行った。投与3ヶ月後に脳を取り出し、免疫組織学的にベクターの発現を検討した。海馬注入群では海馬に、血管内投与群では海馬を含む全脳に目的遺伝子の発現を認めた。両群ともシナプス関連分子クター投与群がEGFP投与群に対し、てんかんを抑制する傾向を示したが、血管内投与群が有意に発作を抑制した。このことは、血管内投与による脳全体の興奮抑制がより発作を抑制する可能性を示したものである。

現在までの達成度

2: おおむね順調に進展している

理由

ELの発作焦点が海馬と大脳皮質の一部にあり、抑制系に脆弱性があるという、初年度の基礎的研究成果を踏まえ、本年度は抑制系シナプス関連分子の遺伝子を発現するAAVベクターを作成し、実際の投与を行った。従来のような海馬への定位手術による投与と共に血管内投与を行い、組織学的に発現を確認した。両群間およびEGFPコントロール群との比較を行い、定量的にてんかん抑制効果を確認した。現在は投与個体数を増やしているところであり、統計学的により信頼できるデータを獲得中である。

今後の研究の推進方策

抑制系シナプス関連分子搭載AAVベクター投与マウスのnを増やし、信頼出来るデータを獲得すること。小動物での効果が確認された場合、ミニブタモデルでてんかんモデルを作成し、同ベクターを投与し、大型動物での効果を確認、臨床応用への道筋を付ける予定である。Nを増やした結果、今回の抑制系シナプス関連分子によるてんかん抑制効果が乏しい場合は、別の抑制系分子の効果を試みる。

次年度使用額が生じた理由

AAVベクター投与マウス数が統計解析にまだ、十分ではないこと。単一種類の分子しか投与していないこと。また、経費のかかる大型動物（ブタ）を使用しなかったこと等による。

次年度使用額の使用計画

今後、投与マウス数、投与分子数を増やし、ミニブタによる実験も追加予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Determination of epileptic focus side in mesial temporal lobe epilepsy using long-term non-invasive fNIRS/EEG monitoring for presurgical evaluation (2015)
  • 著者名/発表者名: Rizki E, Uga M, Dan I, Dan H, Tsuzuki D, Mizutani T, Sano T, Yokota H, Oguro K, and Watanabe E
  • 雑誌名: Neurophotonics 巻: 2 ページ: 未定
• [雑誌論文] Anterograde C1ql1 signaling is required in order to determine and maintain a single-winner climbing fiber in the mouse cerebellum. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kakegawa W, Mitakidis N, Miura E, Abe M, Matsuda K, Takeo YH, Kohda K, Motohashi J, Takahashi A, Nagao S, Muramatsu S, Watanabe M, Sakimura K, Aricescu AR, Yuzaki M.
  • 雑誌名: Neuron 巻: 81(2) ページ: 316-329
  • DOI: 10.1016/j.neuron.2014.12.020.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] In utero gene therapy rescues microcephaly caused by Pqbp1-hypofunction in neural stem progenitor cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ito H, Shiwaku H, Yoshida C, Homma H, Luo H, Chen X, Fujita K, Musante L, Fischer U, Frints SG, Romano C, Ikeuchi Y, Shimamura T, Imoto S, Miyano S, Muramatsu SI, Kawauchi T, Hoshino M, Sudol M, Arumughan A, Wanker EE, Rich T, Schwartz C, Matsuzaki F, Bonni A, Kalscheuer VM, Okazawa H.
  • 雑誌名: Mol Psychiatry 巻: 20(4) ページ: 459-471
  • DOI: 10.1038/mp.2014.69. Epub 2014 Jul 29.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Direct cortical hemodynamic mapping of somatotopy of pig nostril sensation by functional near-infrared cortical imaging (fNCI). (2014)
  • 著者名/発表者名: Uga M, Saito T, Sano T, Yokota H, Oguro K, Rizki EE, Mizutani T, Katura T, Dan I, Watanabe E.
  • 雑誌名: Neuroimage 巻: 91 ページ: 138-145
  • DOI: 10.1016/j.neuroimage.2013.12.062. Epub 2014 Jan 11.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Electroconvulsive seizures enhance autophagy signaling in rat hippocampus. (2014)
  • 著者名/発表者名: Otabe H, Nibuya M, Shimazaki K, Toda H, Suzuki G, Nomura S, Shimizu K.
  • 雑誌名: Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 巻: 50 ページ: 37-43
  • DOI: 10.1016/j.pnpbp.2013.11.012. Epub 2013 Dec 4.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Focus diagnosis for intractable epilepsy by fNIRS (2014)
  • 著者名/発表者名: Oguro K, Yokota H, Mizutani T, Rizki EE Hirai M, Dan I, Watanabe E
  • 学会等名: fNIRS 2014
  • 発表場所: Montreal, Canada
  • 年月日: 2014-10-10 – 2014-10-12
• [学会発表] ELマウスにおけるてんかん発作時および間欠期脳血流の検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小黒恵司、島崎久仁子、横田英典、村島善也、間賀田泰寛、渡辺英寿
  • 学会等名: 第48回日本てんかん学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2014-10-02 – 2014-10-03
• [学会発表] Diagnosis of focus side in intractable mesial temporal epilepsy by fNIRS during spontaneous seizure (2014)
  • 著者名/発表者名: Oguro K, Yokota H, Mizutani T, Rizki EE Hirai M, Dan I, Watanabe E
  • 学会等名: 11th European Congress on Epilepsy
  • 発表場所: Stockholm, Sweden
  • 年月日: 2014-06-29 – 2014-07-03