| 研究課題/領域番号 |
25460530
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
久堀 智子 大阪大学, 微生物病研究所, 特任講師(常勤) (20397657)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 細菌 / 病原性 / 分泌系 / 結晶 / タンパク質複合体 / レジオネラ |
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| 研究実績の概要 |
病原細菌レジオネラが細胞表層に持つ IVB 型タンパク質分泌系の中で、DotI/DotJ 複合体は基質タンパク質を通過させるチャネルを細胞内膜上に形成すると考えられる。25 年度までに、申請者らは DotI ペリプラズム領域の結晶構造を明らかにし、また複合体を形成する DotI/DotJ のモル比を生化学的解析により明らかにした。この結果を受けて、DotI/DotJ 複合体の結晶構造解析を目指し、２６年度には膜透過部分を含む DotI/DotJ の安定複合体を大腸菌で大量に発現させることを試みた。しかしながら、結晶化に十分と考えられる純度と量の試料はまだ得られていない。
一方、結晶構造解析の結果、機能的に重要だと想定された複数のアミノ酸残基に部位特異的置換変異を導入し、IVB 型分泌系の一つの基質として同定されている DotA タンパク質の輸送をリードアウトとした機能解析を行なった。その結果、配列上の類似性を示さないが、構造的ホモログであることが明らかとなった IVA 型分泌系の VirB８ の構造上同じ部位に位置する複数のアミノ酸残基の重要性が明らかとなった。このことから、IVA 型と IVB 型に共通する部分構造体の存在が示唆された。
また、蛍光顕微鏡法により細菌細胞内での DotI の局在を調べた結果、 IVB 型分泌系の中核複合体構成タンパク質とは異なる局在が認められた。このことから、感染時における DotI の局在変化の検出を試みているが、感染細胞内での検出が困難であるためまだ実現に至っていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
DotI/DotJ 複合体の結晶化は複合体精製の段階での技術的困難から、まだ実現できていない。DotI/DotJ 複合体に相互作用する IVB 型分泌系のコンポーネントタンパク質は非感染条件下で見つけ出すことができた。この結果をふまえての感染条件下での解析は、検出の困難からまだ結果を出せていない状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
DotI/DotJ 複合体を安定に単離、精製することは技術的な困難を伴うことが明らかになった。代案としていた接合伝達系オーソログである TraM の膜透過部分を含んだ全長からなる多量体に関しても同じ困難が予想される。このため、方策を切り替え、レジオネラの細胞膜を含んだ状態での IVB 型分泌系の全体像をクライオトモグラフィーなどによって可視化する計画を進めていることと連動して、DotI/DotJ 存在下、非存在下での構造的違いを検出し、DotI/DotJ 複合体が基質輸送のチャネルとして機能しうる局在を示すかどうかに焦点を当てた解析を今後行なってゆきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
DotI/DotJ 複合体の精製後、結晶化に進める予定で結晶化用スクリーニング試薬などの購入を見込んでいたが、精製の段階で技術的な問題が見つかったため、結晶化に進む事ができなかった。このため予定していた試薬の不要分ができた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
計画の変更に伴い、必要となる電子顕微鏡構造解析のための試料調整等に要する試薬などの購入経費に充填することとしたい。
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