| 研究課題/領域番号 |
25460539
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
大岡 唯祐 宮崎大学, 医学部, 助教 (50363594)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | Escherichia albertii / ゲノム解析 / 病原性 |
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| 研究概要 |
Escherichia albertiiは、近年、大腸菌の近縁種としてその存在が知られるようになった新しい腸管病原菌である。しかしながら、その基本性状や病原機構、生息域や各種動物での常在性など未だ不明な点が多い。申請者は、最近、E. albertiiの中で系統の異なる3株について全ゲノム配列を決定し、大腸菌株との全ゲノム配列比較から、本菌のスクリーニングや大腸菌との鑑別に有用な種特異的領域を多数同定した。また、病原関連候補遺伝子群についても多数同定した。本研究では、E. albertiiについて、①有用な検出系の開発、②検出系を利用した保菌宿主と常在性の検証、③病原機構の解析を行い、本菌の病原菌種としての特性を明らかにすることを目的とした。平成25年度は、multiplex PCRによる検出系構築のための種特異的領域を絞り込む目的で、申請者らが保有するE. albertii株30株（ヒト下痢患者由来株、トリ由来株、ネコ由来株 [うち3株については全ゲノム配列を取得済み]）について、Illumina MiSeqを用いてドラフトゲノム配列を取得し、種内での共通領域の抽出を行った。得られた種特異的配列を標的としたPCR検出系を構築し、ヒト及び各種動物の糞便についてPCRスクリーニングを実施した。また、病原機構の解明のため、3型分泌系を中心とした病原関連候補遺伝子群の変異株を作成するため、汎用されている手法の改良を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度の研究計画として、①E. albertiiの検出系の開発、②健常人及び各種動物の腸管におけるE. albertiiの分布の検証と常在株の分離、③常在株のドラフトゲノム配列を用いた患者由来株（病原株）とのゲノム比較、④培養細胞への感染実験による2種類の3型分泌系を中心とした病原機構の解明の4項目を計画した。
項目①に関して、multiplex PCRを用いた検出系については、現在までに有用なプライマーペアを5組作成した。また、培地の開発については、E. albertii 30株とのゲノム比較から種特異的遺伝子群を176遺伝子同定しており、その中の代謝系遺伝子群も同定出来ている。項目②に関して、項目①で作成したプライマーペアを用いて、ヒト、ウシ, ブタ, ニワトリの計500検体の便についてPCRスクリーニングを行い、保菌宿主について興味深い結果を得ている。また、PCR陽性検体については菌株の分離を進めている段階にある。項目③に関しては、既に取得しているドラフトゲノム配列を用いて、患者由来株と動物由来株とのゲノム比較を進めている。項目④に関しては、3型分泌系等の病原関連候補遺伝子群の変異株を作成中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度に引き続き、E. albertiiの種特異的配列を標的としたmultiplex PCRの完成を目指す。また、これまでに得られている代謝系関連遺伝子群の基質検索を行い、本菌の分離同定培地の開発を目指す。保菌宿主の検索に関しては、野鳥などの野生動物や環境にも対象を広げて検索を行う。病原株と非病原株とのゲノム比較解析のため、システム構築を進める。病原機構の解析を行うにあたり、当初は汎用されている手法による当該遺伝子(群)の変異株作成が困難であったが、方法の改良により変異株作成が可能になったことから、病原関連候補遺伝子群の変異株セットを作成し、野生株との比較を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
H25年度は、E. albertiiの検出系の開発に関して、multiplex PCR系および選択培地の開発を目標としたが、本年度は主に、患者及び動物由来のドラフトゲノム配列の比較から、multiplex PCR系の構築を行った。しかしながら、選択培地の開発に関しては、種特異的代謝系遺伝子群の同定は出来たものの基質同定には至らないものが多くあったため、選択培地を作成する段階まで進めることができなかった。また、病原機構の解明のための感染実験に関しては、汎用されている手法での変異株作成が困難であったため、変異株作成法の改良を主に進めており、感染実験を行うまでには至らなかった。これらの事由により、使用予定の額を消費するに至らなかった。なお、病原機構の解析については、頻度は低いものの、汎用されている手法の改良によって変異株の作成が可能となったため、次年度以降、順調に進めることができる。
次年度（平成26年度）は主に、①multiplex PCR検出系改良のためのprimer作成及びPCR試薬、②検出PCR陽性検体からの菌株分離同定に必要な試薬（検出培地及びPCRスクリーニング）、③分離した常在株のドラフトゲノム解析、④ゲノム比較解析のためのシステム構築、②感染実験関連（変異株作成試薬、細胞培養器具と試薬、実験動物の購入など）に使用する。また、京都及び大阪で開催される国内学会での発表及び論文発表を予定しており、その費用として使用する。
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